應(yīng)用FRTL-5細(xì)胞建立環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性甄別方法及其干擾機(jī)制研究.pdf

1、隨著環(huán)境負(fù)荷的增加，暴露于某些環(huán)境化學(xué)物會影響機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的增加，人類和野生動物生長發(fā)育不良效應(yīng)的增加，及不良生態(tài)效應(yīng)的增加，使環(huán)境內(nèi)分泌干擾物成為國際關(guān)注的熱點(diǎn)問題。環(huán)境甲狀腺激素干擾物屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。目前，還無有效可行的環(huán)境甲狀腺激素干擾物甄別方法。 FRTL-5細(xì)胞株是COON等人于1980年成功建立的一種激素依賴性的、來源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的、可幾乎無限傳代的正常細(xì)胞株。該細(xì)胞株具有攝碘和分

2、泌甲狀腺球蛋白功能，已被用于甲狀腺腫的病理研究、甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)碘的機(jī)制研究以及甲狀腺腫瘤發(fā)生機(jī)制等研究。本研究旨在充分利用FRTL-5細(xì)胞分泌甲狀腺球蛋白和攝碘功能，建立甄別干擾甲狀腺球蛋白合成和(或)分泌，及攝碘功能的體外甲狀腺激素干擾物甄別方法，并探索其干擾機(jī)制。 本研究分三部分： 第一部分：殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細(xì)胞毒性和增殖的影響。運(yùn)用MTT法測細(xì)胞倍增時間和<'3>H摻入法分別檢測它們

3、對FRTL-5細(xì)胞倍增時間和細(xì)胞DNA合成的影響，目的是確保在本課題劑量范圍內(nèi)，殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性。細(xì)胞倍增時間結(jié)果顯示，殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈處理FRTL-5細(xì)胞后，在所設(shè)定的劑量范圍內(nèi)下測得的倍增時間分別為：對照組：41.88±2.12；殺草強(qiáng)組：40.34±4.54；乙烯硫脲組：41.21±2.41；五氯苯酚組：41.56±2.87;二甲戊樂靈組41.88±6.9

4、0。與對照組比均無顯著性差異。且殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈作用24小時、48小時、72小時和96小時后，均無顯著細(xì)胞毒性(p>0.05)。 <'3>H摻入法結(jié)果顯示，殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈處理組各劑量組與對照組相比，對FRTL-5細(xì)胞DNA的合成均無顯著性影響(p>0.05)。但隨著乙烯硫脲和五氯苯酚濃度的增加，F(xiàn)RTL-5細(xì)胞DNA的合成有降低的趨勢，說明它們對細(xì)胞DNA合成可能有潛在毒性。 第二部

5、分：殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細(xì)胞甲狀腺激素合成相關(guān)基因的影響。目的是探索四種受試物可能的干擾機(jī)制及其靶基因，從基因水平探索F R TL-5細(xì)胞中甲狀腺激素合成相關(guān)基因是否可用于環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性的甄別。采用RT-PCR方法檢測tg，tpo，his，tshr，ttf-1，pax-8和gapdh等基因。 結(jié)果顯示： (1)殺草強(qiáng)各劑量組tg基因的轉(zhuǎn)錄均顯著高于對照組，ttf-1基因僅在

6、高劑量組比對照組有顯著增強(qiáng)。tpo和his基因mRNA表達(dá)水平，與對照組比無顯著性差異。tshr和pax-8基因mRNA表達(dá)水平在高劑量組比對照組有顯著性降低。 (2)乙烯硫脲處理：nis基因在低、高劑量組均比對照組有顯著性降低，tpo基因在高劑量組比對照組有顯著性降低。Tg，tshr,ttf-1和pax-8基因mRNA表達(dá)水平，與對照組均無顯著性差異，tg基因有隨乙烯硫脲濃度增加，mRNA表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)的趨勢，tshr和pa

7、x-8基因mRNA表達(dá)水平則有隨著乙烯硫脲濃度增加，而逐漸降低的趨勢。 (3)五氯苯酚處理：nis基因在低、高劑量組與對照組比有顯著性差異；tpo基因高劑量組比對照組有顯著降低。Tg，tshr,ttf-1和pax-8基因mRNA表達(dá)水平，與對照組均無顯著性差異。 (4)二甲戊樂靈處理：tpo基因在高劑量組表達(dá)顯著高于對照組，pax-8基因各劑量組表達(dá)均顯著高于對照組。Tg，tshr,ttf-1和nis基因mRNA表達(dá)水平

8、，與對照組比均無顯著性差異。 RT-PCR結(jié)果提示，提示四種化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性與其對甲狀腺激素合成相關(guān)基因影響有關(guān)，但四種化學(xué)物對相關(guān)基因的影響不盡相同，表明其作用機(jī)理可能有所不同。殺草強(qiáng)可影響tg，ttf-1，pax-8和tshr基因的mRNA表達(dá)，乙烯硫脲和五氯苯酚可能影響tpo和his基因的mRNA．表達(dá)，二甲戊樂靈可能影響tpo和pax-8基因的mRNA表達(dá)。也表明甲狀腺激素合成相關(guān)基因應(yīng)該可以作為甄別指標(biāo)。

9、 第三部分：殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細(xì)胞攝碘功能和甲狀腺激素合成相關(guān)蛋白的影響。目的是利用同位素示蹤法、放免法、細(xì)胞免疫熒光法和細(xì)胞免疫化學(xué)法，從蛋白水平觀察殺草強(qiáng)、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細(xì)胞甲狀腺激素生物合成相關(guān)蛋白和攝碘功能的影響。探索FRTL-5細(xì)胞中甲狀腺激素合成相關(guān)蛋白和攝碘能力是否可用于環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性的甄別。 同位素示蹤法結(jié)果顯示： (1)

10、殺草強(qiáng)，處理12小時后，細(xì)胞總攝碘能力顯著強(qiáng)于對照組；處理24小時后，細(xì)胞總攝碘能力顯著低于對照組。 (2)乙烯硫脲：處理12小時后，細(xì)胞總攝碘能力顯著增強(qiáng)于對照組的；處理24小時后，高劑量組的細(xì)胞總攝碘能力顯著低于對照組。 (3)五氯苯酚，處理12小時后，細(xì)胞總攝碘能力顯著強(qiáng)于對照組；處理24小時后，與對照組的比，無顯著差異。 (4)二甲戊樂靈，處理12小時后，細(xì)胞總攝碘能力顯著強(qiáng)于對照組；處理24小時后，細(xì)胞

11、總攝碘能力顯著低于對照組。 放免法結(jié)果顯示，殺草強(qiáng)、乙烯硫脲和五氯苯酚處理的，中、高劑量組培養(yǎng)液中甲狀腺球蛋白濃度顯著低于對照組，且乙烯硫脲和五氯苯酚各劑量組之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系。二甲戊樂靈組，中、高劑量組培養(yǎng)液中甲狀腺球蛋白濃度則顯著高于對照組。 細(xì)胞免疫化學(xué)法結(jié)果顯示，殺草強(qiáng)處理組，高劑量組的甲狀腺球蛋白陽性細(xì)胞積分光密度顯著低于對照組。乙烯硫脲處理組、五氯苯酚處理組和二甲戊樂靈處理組與對照組比，甲狀腺球蛋白陽性細(xì)胞

12、積分光密度值無顯著差異。 殺草強(qiáng)處理，各劑量組TTF-1的陽性細(xì)胞積分光密度值，與對照組比無顯著性變化。乙烯硫脲處理，各劑量組TTF-1的陽性細(xì)胞積分光密度值顯著低于對照組的。五氯苯酚處理，中、高劑量組TTF-1的陽性細(xì)胞積分光密度值顯著低于對照組。二甲戊樂靈處理組，高劑量組的TTF-1的陽性細(xì)胞積分光密度值顯著低于對照組的。 細(xì)胞免疫熒光法結(jié)果顯示，殺草強(qiáng)處理， TSHR的陽性細(xì)胞積分光密度值顯著低于對照組。乙烯硫脲處

13、理，低劑量組TSHR的陽性細(xì)胞積分光密度值顯著高于對照組，中劑量組TSHR的陽性細(xì)胞積分光密度值與對照組的比，無顯著性差異，高劑量組TSHR的陽性細(xì)胞積分光密度值顯著低于對照組的。五氯苯酚和二甲戊樂靈處理組各劑量組的陽性細(xì)胞積分光密度值與對照組比較無顯著性差異。 同位素示蹤法、放免法、細(xì)胞免疫熒光法和細(xì)胞免疫化學(xué)法表明，殺草強(qiáng)和乙烯硫脲可影響FRTL-5細(xì)胞的總攝碘能力，抑制甲狀腺球蛋白的合成和影響促甲狀腺激素受體的表達(dá)，五氯苯

14、酚和二甲戊樂靈可影響FRTL-5細(xì)胞總攝碘能力和甲狀腺球蛋白合成/分泌。本研究結(jié)果還表明，F(xiàn)RTL-5細(xì)胞的攝碘能力、合成/分泌甲狀腺球蛋白以及促甲狀腺激素受體的表達(dá)等均有可能用作甄別環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性的指標(biāo)綜上所述，F(xiàn)RTL-5細(xì)胞的甲狀腺激素合成相關(guān)基因、蛋白和細(xì)胞攝碘能力等均有可能用于甄別環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性，tpo基因、nis基因、胞外TG濃度、TSGR表達(dá)水平和細(xì)胞總攝碘能力等可能有望成為甄別指標(biāo)。但其靈