林蘭教授治療甲亢經(jīng)驗(yàn)及甲亢寧膠囊調(diào)控FRTl-5細(xì)胞ERK通路的機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥是當(dāng)前最常見(jiàn)的甲狀腺疾病之一。目前尚缺乏針對(duì)性的治療藥物，常規(guī)抗甲狀腺藥物無(wú)法解決甲狀腺細(xì)胞過(guò)度增殖和甲亢復(fù)發(fā)問(wèn)題。林蘭教授從醫(yī)50余載，對(duì)甲亢的治療等方面認(rèn)識(shí)深刻，研發(fā)了許多有效的治療方劑，中藥甲亢寧膠囊（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“甲亢寧”）即是其防治甲亢的臨床經(jīng)驗(yàn)的精髓之一。本論文首先對(duì)導(dǎo)師林蘭教授治療甲亢的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的整理，然后以體外培養(yǎng)的FRTL-5甲狀腺細(xì)胞作為研究對(duì)象，從干擾和過(guò)表達(dá)兩個(gè)方面，探討甲亢寧通過(guò)調(diào)控ERK信號(hào)

2、通路，抑制甲狀腺細(xì)胞增殖、促其凋亡從而調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)的可能分子機(jī)制。
　　1.臨床研究
　　目的:基于導(dǎo)師林蘭教授治療甲亢的臨床資料，通過(guò)數(shù)據(jù)分析，總結(jié)其治療甲亢的方藥運(yùn)用規(guī)律。結(jié)合與導(dǎo)師交流，人機(jī)結(jié)合，以人為主，總結(jié)其治療甲亢肝損害、甲亢合并白細(xì)胞減少癥、甲亢合并突眼、甲亢伴月經(jīng)病等的臨床經(jīng)驗(yàn)。為總結(jié)和提煉甲亢中醫(yī)藥防治規(guī)律提供循證依據(jù)。
　　方法:將2013年12月-2015年12月林蘭教授在廣安門(mén)醫(yī)院內(nèi)分泌門(mén)

3、診確診的160例甲亢患者的437診次的病例錄入EXCEL2007表格。利用SPSS19.0軟件、weka3.7數(shù)據(jù)挖掘軟件、Liquorice數(shù)據(jù)挖掘軟件，運(yùn)用頻數(shù)分析、聚類(lèi)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等方法分析林蘭教授處方用藥規(guī)律。通過(guò)與導(dǎo)師交流，整理導(dǎo)師治療甲亢、甲亢合并肝損害、甲亢合并白細(xì)胞減少癥、甲亢合并突眼、甲亢伴月經(jīng)病等的臨床經(jīng)驗(yàn)。
　　結(jié)果:(1)篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的甲亢病例160例，得到治療本病所涉及的中藥167味，使用總

4、頻次為9032次，其中頻數(shù)在10次以上的藥物共有64味，總頻數(shù)為8634次。其中生龍骨、煅磁石、珍珠母、麥冬、酸棗仁、五味子、夏枯草、法半夏、山慈菇等是林老治療甲亢的核心藥物。(2)將林教授437診次治療甲亢的處方中所有中藥按照藥物出現(xiàn)的總頻次進(jìn)行排序，頻次超過(guò)10次的作為高頻中藥。參考第七版《中藥學(xué)》教材及《中華本草》，將69味高頻中藥按照功效進(jìn)行分類(lèi)，并將各類(lèi)中藥中的所有藥物使用頻次加和并排序。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，林蘭教授治療甲亢使用最多

5、的是補(bǔ)虛藥、安神藥，其次為清熱藥、活血化瘀藥、平肝息風(fēng)藥等。在補(bǔ)虛類(lèi)藥物使用上，以用補(bǔ)血藥和補(bǔ)陰藥為主，補(bǔ)氣藥和補(bǔ)陽(yáng)藥為次。林教授治療甲亢常用具有滋陰潛陽(yáng)、安神功效的中藥。(3)采用SPSS19.0軟件對(duì)高頻中藥進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示林蘭教授的治療甲亢的處方分為九類(lèi):益母草、丹皮、山萸肉、紫河車(chē)、當(dāng)歸;鹽杜仲、澤瀉、炒白術(shù)、覆盆子、益智仁、香附、黃連、木香、紅花、川芎、檀香、生黃芪、制遠(yuǎn)志、決明子;茵陳、黃柏、生牡蠣、珍珠母;白芍、生龍

6、骨、五味子、夏枯草、麥門(mén)冬、太子參、柏子仁、酸棗仁;山慈菇、牛蒡子;枸杞子、煅磁石、鉤藤;郁金，元胡;半夏，枳實(shí)。(4)采用Liquorice數(shù)據(jù)挖掘軟件對(duì)高頻中藥進(jìn)行分析，結(jié)果顯示林蘭教授的治療甲亢的核心處方以滋陰潛陽(yáng)、化痰散結(jié)、益氣養(yǎng)陰功效為特點(diǎn)，生龍骨、煅磁石、夏枯草、枸杞子、鉤藤、太子參、麥冬、白芍、五味子、生地、熟地、柏子仁、酸棗仁是最常見(jiàn)的方劑組合。(5)采用weka3.7數(shù)據(jù)挖掘軟件，運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則方法分析常用藥對(duì)，并結(jié)合與

7、導(dǎo)師交流，總結(jié)出林教授臨床常使用的藥對(duì)為:熄風(fēng)潛陽(yáng)組合—生龍骨、煅磁石;化痰散結(jié)組合—山慈菇、牛蒡子、浙貝母、連翹;疏肝理氣組合—柴胡、白芍;理氣化痰組合—半夏、枳實(shí)、郁金、元胡;益氣養(yǎng)陰組合—太子參、麥冬、五味子;健脾燥濕組合—蒼術(shù)、厚樸;安神組合—生龍骨、生牡蠣、煅磁石、珍珠母;酸棗仁、柏子仁;健脾化濕組合—茯苓、澤瀉;滋補(bǔ)肝腎組合—覆盆子、益智仁、杜仲;養(yǎng)肝明目組合—枸杞子、決明子;祛風(fēng)明目組合—青葙子、密蒙花。(6)通過(guò)與導(dǎo)師交

8、流，總結(jié)了導(dǎo)師治療甲亢分氣滯痰凝、陰虛陽(yáng)亢、陰虛火旺、氣陰兩虛四型論治，重視化痰活血，強(qiáng)調(diào)配合西藥治療。導(dǎo)師治療甲亢合并突眼，強(qiáng)調(diào)辨主癥論治。治療甲亢合并肝損害，提倡分期論治。治療甲亢伴白細(xì)胞減少癥，以益氣滋陰養(yǎng)血為治療大法。治療甲亢伴月經(jīng)病，應(yīng)用甲狀腺藥物維持治療的同時(shí)，運(yùn)用中藥人工周期療法。
　　結(jié)論:本課題首次利用頻數(shù)分析、聚類(lèi)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，對(duì)林蘭教授治療甲亢的臨床用藥規(guī)律進(jìn)行了分析，并結(jié)合口傳心授

9、，總結(jié)出了林蘭教授對(duì)甲亢、甲亢突眼、甲亢合并肝損害、甲亢合并白細(xì)胞減少、甲亢伴月經(jīng)病的處方用藥規(guī)律和治療體會(huì)。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:從ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路探討中藥甲亢寧膠囊治療甲亢的分子機(jī)制。
　　方法:以原代培養(yǎng)的FRTL-5細(xì)胞為研究對(duì)象，采用CCK-8法篩選出甲亢寧抑制FRTL-5細(xì)胞增殖的最佳濃度，作為干預(yù)FRTL-5細(xì)胞的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)共設(shè)立對(duì)照組(Con)、甲亢寧組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組

10、、siRNA陰性序列組(NC)、siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)慢病毒組、甲亢寧+過(guò)表達(dá)慢病毒組、空病毒組(NC)等組別，分別采用CCK-8法檢測(cè)甲亢寧對(duì)各組細(xì)胞增殖情況的影響、放免法測(cè)定各組細(xì)胞上清中的cAMP釋放量、AV/PI雙染法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率、Western Blot法以及RT-qPCR法觀察ERK通路上增殖、凋亡相關(guān)基因(c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、Caspase-9、CyclinD1、Bcl-2、Bax) mRN

11、A和蛋白表達(dá)的變化。以ERK1/2為切入點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)阻斷ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，并應(yīng)用慢病毒載體對(duì)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行過(guò)度活化，從ERK1/2基因沉默和過(guò)表達(dá)兩方面研究甲亢寧調(diào)控FRTL-5細(xì)胞ERK通路的機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)出的FRTL-5細(xì)胞，凍存了足夠的細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。(2)本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)法觀察出不同甲亢寧濃度、不同干預(yù)時(shí)間的FRTL-5細(xì)胞增殖情況，經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最

12、終確定以5.438mg/ml的含甲亢寧的F12完全培養(yǎng)基干預(yù)的第24h作為FRTL-5細(xì)胞的干預(yù)濃度最為適宜。(3)采用CCK-8法證實(shí)了甲亢寧對(duì)FRTL-5細(xì)胞增殖具有抑制作用。(4)采用AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)了甲亢寧對(duì)轉(zhuǎn)染ERK1/2-siRNA和感染ERK1/2過(guò)表達(dá)慢病毒的FRTL-5細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，甲亢寧組細(xì)胞發(fā)生凋亡(P＜0.01)，經(jīng)ERK1/2-siRNA干擾后FRTL-5細(xì)胞發(fā)生凋亡，

13、甲亢寧協(xié)同組細(xì)胞凋亡更加顯著(P＜0.05)，ERK1/2-siRNA組、ERK1/2-siRNA陰性序列組的凋亡率與對(duì)照組相比增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與甲亢寧組相比，甲亢寧+ERK1/2-siRNA組、甲亢寧+ERK1/2慢病毒組的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組的細(xì)胞凋亡率與甲亢寧組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與ERK1/2-siRNA陰性序列組相比，甲亢寧+ERK1/2-siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P

14、＜0.01)。與空病毒組相比，甲亢寧組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組的凋亡率明顯升高(P＜0.01)。(5)采用放免法測(cè)定各組細(xì)胞上清中的cAMP釋放量，與對(duì)照組相比，ERK1/2-siRNA組、ERK1/2-siRNA陰性序列組的cAMP釋放量無(wú)顯著差異，其余各組的cAMP釋放量與對(duì)照組相比，均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，其中甲亢寧組的cAMP釋放量降低最為顯著。與甲亢寧組相比，對(duì)照組、ERK1/2

15、-siRNA組、ERK1/2-siRNA陰性序列組的cAMP釋放量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。(6)RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，甲亢寧組、ERK1/2-siRNA組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組的c-Raf、 ERK1、ERK2、CyclinD1、Bcl-2 mRNA表達(dá)量均顯著降低(P＜0.01);甲亢寧組的BaxmRNA、Caspase-9mRNA表達(dá)量增高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ERK1/2-si

16、RNA組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組的BaxmRNA、Caspase-9mRNA表達(dá)量顯著增高(P＜0.01);與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)慢病毒組、甲亢寧+慢病毒組的c-Raf、 ERK1、ERK2、Bax的mRNA表達(dá)量明顯增高(P＜0.01)，CyclinD1mRNA、Bcl-2mRNA的表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。(7) WesternBlot法檢測(cè)結(jié)果顯示，甲亢寧組、ERK1/2-siRNA組、甲亢寧協(xié)同組的c-Raf、p

17、-ERK1/2、ERK1/2、CyclinD1、Bcl-2的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.01);甲亢寧組的Caspase-9蛋白表達(dá)量增高(P＜0.01)，ERK1/2-siRNA組、甲亢寧協(xié)同組Bax、Caspase-9的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01);與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)慢病毒組、甲亢寧+慢病毒組的c-Raf、 p-ERK1/2、ERK1/2、Bax的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，CyclinD1mRNA、Bcl-2的蛋白表達(dá)

18、明顯下調(diào)(P＜0.01)。
　　結(jié)論:ERK1/2-siRNA可以協(xié)同甲亢寧所致的抑制FRTL-5細(xì)胞增殖、促其細(xì)胞凋亡的作用;ERK1/2的過(guò)表達(dá)使FRTL-5細(xì)胞獲得更高的增殖與抗凋亡能力，對(duì)甲亢寧的抗藥性顯著增加;甲亢寧對(duì)ERK1/2的磷酸化起阻斷作用，甲亢寧通過(guò)調(diào)控ERK1/2的表達(dá)從而調(diào)節(jié)FRTL-5細(xì)胞中c-AMP、c-Raf、 Bax、Bcl-2、Caspase-9及CyclinD1的表達(dá)，而抑制FRTL-5細(xì)胞增殖