因?qū)幤瑢?duì)甲亢性肝損害大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺功能亢進(jìn)癥(Hyperthyroidism,簡(jiǎn)稱甲亢),是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,常累及全身多系統(tǒng)、多器官,其中常見而又往往易被忽視的是肝臟損害。甲亢性肝損害的發(fā)病率高達(dá)37％～76.7％,相當(dāng)多的甲亢患者伴有肝臟損害,引起肝功能異常、肝腫大,黃疸等。肝臟是人體重要的代謝器官,肝損害引起肝細(xì)胞損害、再生、肝纖維化,并可以發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭。因此,關(guān)于肝損害機(jī)制及對(duì)其保護(hù)和治療藥物的研究就顯得非常迫切,已經(jīng)引起許多學(xué)者的關(guān)注

2、,成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)課題。甲亢性肝損害的治療,多以控制甲亢臨床癥狀為主,而保肝、降酶,避免肝臟進(jìn)一步損害的治療藥物較少。因此,我們?cè)噲D研究既抗甲亢又保肝的中藥制劑以填補(bǔ)其空白。因?qū)幤悄戏结t(yī)院運(yùn)用益氣養(yǎng)陰軟堅(jiān)散結(jié)原理組成的,既治療甲亢,控制甲亢癥狀和體征,尤其是治療或減少甲亢并發(fā)癥、降低副作用、減少甲亢復(fù)發(fā)方面具有明顯優(yōu)勢(shì),又有保肝作用的中藥制劑。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明因?qū)幤苊黠@降低大鼠血液中甲狀腺激素含量、延長(zhǎng)甲亢小鼠耐缺氧

3、時(shí)間、提高小鼠非特異性免疫功能,但因?qū)幤委熂卓悍乐胃螕p害的作用機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。因此,本課題通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn),從受體和細(xì)胞水平,探討因?qū)幤委熂卓盒愿螕p害的分子作用機(jī)制,為藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一章、因?qū)幤瑢?duì)甲亢性肝損害大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察因?qū)幤瑢?duì)甲亢性肝損害大鼠模型的作用,檢測(cè)血清中甲狀腺激素水平、肝功能、氧化應(yīng)激參數(shù)的變化,觀察肝臟病理組織學(xué)改變,探討氧化應(yīng)激對(duì)甲亢

4、性肝損害的影響,為進(jìn)一步研究藥物作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選用SD雌性大鼠60只,隨機(jī)分為6組,除空白對(duì)照組外,其余大鼠給L-甲狀腺素鈉800μg/kg·d)灌胃30 d,制備甲亢性肝損害模型。大鼠造模成功后給予因?qū)幤?0.6g/(kg·d))、中(1.2 g/(kg·d))、高(2.4g/(kg·d))劑量,甲亢靈(1.2g/(kg·d))灌胃治療30 d,處死大鼠后收集血樣和肝組織,采用放射免疫法測(cè)定血清中三碘甲

5、腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)含量,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平,分光光度法測(cè)定肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)值和Na+-K+-ATP酶活性。取肝臟進(jìn)行光鏡和電鏡觀察。
　　 結(jié)果:
　　 (1)血清中T3、T4、TSH值

6、的變化:與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中T3、T4顯著升高,TSH顯著降低(P<0.01)。因?qū)幤?、中、高劑量組與模型組比較均顯著降低T3、T4含量、升高TSH含量(P<0.05,P<0.01)。
　　 (2)血清中AST、ALT、ALP含量的變化:與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清AST、ALT、ALP含量顯著升高(P<0.01)。因?qū)幤?、中、高劑量組與模型組比較均能顯著降低AST、ALT含量(P<0.05,P<0.01)

7、,因?qū)幤邉┝拷M能降低ALP水平(P<0.05),而因?qū)幤汀⒅袆┝拷MALP水平無顯著性改變(P>0.05)。
　　 (3)肝組織MDA、SOD、GSH-Px、CAT、GSH值和Na+-K+-ATP酶活性的變化:模型組肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)中:MDA增加(P<0.01)； SOD、CAT、GSH—Px、Na+-K+-ATP酶活性降低,GSH含量下降,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。與模型組比較,因?qū)幤委熀?MDA含量降

8、低,呈現(xiàn)劑量依賴性(r=0.449,P<0.01)；因?qū)幤蛣┝可逽OD酶活性作用與因?qū)幤?、高劑量比較有顯著性差異(P<0.01),但因?qū)幤袆┝亢透邉┝勘容^差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；因?qū)幤蛣┝可逤AT酶活性與高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05),而與中劑量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；因?qū)幤逩SH-Px、Na+-K+-ATP酶活性,增加GSH含量(P<0.05),因?qū)幤鲃┝拷M之間無顯著性差異。

9、　　 (4)肝臟光鏡和電鏡病理組織學(xué)改變:模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤、線粒體數(shù)量增多、嵴消失等；因?qū)幤髦委熃M能不同程度改善肝臟病理學(xué)變化:糖原顆粒明顯增多、線粒體數(shù)量減少、腫脹減輕、體積減小。
　　 結(jié)論:因?qū)幤瑢?duì)L-甲狀腺素鈉誘發(fā)的大鼠甲亢性肝損害有明顯保護(hù)作用,能降低模型大鼠血液中甲狀腺激素水平,降低轉(zhuǎn)氨酶含量,改善肝臟病理損害,抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 第二章、因?qū)幤瑢?duì)甲亢性肝損害

10、大鼠肝臟的甲狀腺激素受體、Ⅰ型脫碘酶和細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響
　　 目的:運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)因?qū)幤委煷笫蠹卓盒愿螕p害后,肝臟的甲狀腺激素受體(TR)、Ⅰ型脫碘酶(DioI)和細(xì)胞色素P450(CYP450)基因表達(dá)的變化。
　　 方法:利用雌性大鼠灌服L-甲狀腺素鈉建立甲亢性肝損害大鼠模型。以甲亢靈為陽性對(duì)照藥,因?qū)幤?、中、高劑量治?0d,取部分肝臟通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肝組織內(nèi)TRα1

11、、TRα2、TRβl、DioI、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)肝組織TRα1、TRα2、TRβ1表達(dá)變化:與空白對(duì)照組比較,模型組TRα1表達(dá)上調(diào),TRα2表達(dá)下調(diào),TRβ1表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；因?qū)幤芙档蚑Rα1和TRβ1基因表達(dá)(P<0.05),對(duì)TRα2表達(dá)影響不明顯(P>0.05)。
　　 (2)肝組織DioI表達(dá)變化:模型組DioI表達(dá)與空

12、白對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)(P<0.01),因?qū)幤芙档虳ioI表達(dá),并呈劑量依賴趨勢(shì)(r=-0.792,P<0.01。
　　 (3)肝組織CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2表達(dá)變化:與空白對(duì)照組比較,模型組CYP1A2和CYP3A2表達(dá)下降(P<0.01,P<0.05),而CYP2E1表達(dá)升高(P<0.01)；因?qū)幤芙档虲YP2E1的表達(dá)(P<0.05),但對(duì)CYP1A2和CYP3A2的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。

13、>　　 結(jié)論:因?qū)幤苷{(diào)節(jié)甲亢大鼠肝臟TR、DioI和CYP450基因的異常表達(dá),這可能是因?qū)幤委熂卓盒愿螕p害的分子作用機(jī)制之一。
　　 第三章、因?qū)幤瑢?duì)甲亢性肝損害大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的:觀察因?qū)幤瑢?duì)甲亢大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Fas、Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B細(xì)胞白血病-淋巴瘤-2(Bcl-2)表達(dá)的影響,探討因?qū)幤瑢?duì)甲亢性肝損害的保護(hù)

14、作用及其機(jī)制。
　　 方法:利用雌性大鼠灌服L-甲狀腺素鈉建立甲亢性肝損害動(dòng)物模型。以甲亢靈為陽性對(duì)照藥,因?qū)幤汀⒅?、高劑量組治療30d,取部分肝臟,采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組大鼠肝臟中Fas、FasL、TNF-α的表達(dá),Western-Blot檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)肝臟中Fas、FasL、TNF-α表達(dá)變化:Fas、FasL免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色,主要表達(dá)于細(xì)

15、胞漿中,TNF-α免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色,主要表達(dá)于細(xì)胞漿,細(xì)胞膜和炎細(xì)胞中；空白對(duì)照組有散在少量表達(dá),模型組表達(dá)明顯增高,范圍增大,兩者比較有非常顯著性差異(P<0.01)。同模型組比較,因?qū)幤小⒏邉┝拷M能下調(diào)Fas、FasL、TNF-α表達(dá)(P<0.05)。
　　 (2)肝臟中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)變化:與空白對(duì)照組比較,模型組Caspase-3蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)下降(P<0.01),因?qū)幤?/p>

16、低、中、高劑量組能降低Caspase-3蛋白表達(dá)、升高Bcl-2蛋白表達(dá),與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論:Fas、FasL、TNF-α、Caspase-3和Bcl-2在甲亢性肝損害大鼠的肝臟中表達(dá)異常,因?qū)幤乐渭卓盒愿螕p害的作用可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 第四章、因?qū)幤瑴p輕T3誘導(dǎo)BRL肝細(xì)胞損害的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察因?qū)幤瑢?duì)T3誘導(dǎo)后BRL肝細(xì)胞的增值、肝功能和氧化應(yīng)

17、激的影響,為進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)藥物血清的制備:25只雌性SD大鼠,隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組,因?qū)幤汀⒅?、高劑量組,甲亢靈組。大鼠灌服相應(yīng)劑量的藥物后,腹腔靜脈采血,分離藥物血清。
　　 (2)因?qū)幤瑢?duì)T3誘導(dǎo)BRL肝細(xì)胞損害的影響:建立大鼠肝細(xì)胞T3損害模型,在不同濃度因?qū)幤幬镅遄饔孟?應(yīng)用MTT法測(cè)定藥物作用后細(xì)胞存活率的變化,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)上清液中

18、AST、ALT的含量,分光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD值。
　　 結(jié)果:
　　 (1)BRL細(xì)胞存活率的變化:隨著因?qū)幤帩舛壬?T3損害后的BRL細(xì)胞存活率逐漸增加；因?qū)幤蛣┝拷M與中劑量組比較有顯著性差異(P<0.05),高劑量組和中劑量組比較有升高趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (2)BRL細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST含量的變化:與模型組比較,因?qū)幤茱@著減少ALT、AST的釋放(P<0

19、.05),因?qū)幤袆┝拷M和低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因?qū)幤邉┝拷M與因?qū)幤袆┝拷M比較有降低趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (3)BRL細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD含量的變化:模型組BRL細(xì)胞混懸液中的MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低,和空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,甲亢靈組和因?qū)幤?、高劑量組均能明顯降低MDA含量(P<0.05),因?qū)幤?、中、高劑量組能顯著