原代培養(yǎng)神經(jīng)元類缺血再灌后UCP4的表達(dá)與ROS的關(guān)系及前列地爾干預(yù)的研究.pdf

1、目的：以原代培養(yǎng)神經(jīng)元為研究對象，建立類缺血再灌注損傷模型，探討原代培養(yǎng)神經(jīng)元類缺血再灌后UCP4的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化及前列地爾對其影響。 方法：1、原代神經(jīng)元的培養(yǎng)：取新生24h以內(nèi)的Wistar大鼠，斷頭消毒，無菌條件下分離皮質(zhì)并剝離腦膜，將腦組織剪碎后用胰酶消化，后經(jīng)過濾，離心，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基種植于培養(yǎng)板或玻片上。然后置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后加阿糖胞苷以

2、抑制非神經(jīng)元過度增殖，以后每三天半量換液，并采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)鑒定。2、類缺血再灌注模型的建立：將培養(yǎng)10d的細(xì)胞全量換為DMEM無糖無血清培養(yǎng)基，放入充有90％氮?dú)獾呐囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。然后再換為完全培養(yǎng)基。放入5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。3、實(shí)驗(yàn)分組：將體外培養(yǎng)10d的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對照組(正常組)、類缺血再灌注組(缺血組)、類缺血再灌注加前列地爾組(實(shí)驗(yàn)組)。正常組正常條件培養(yǎng)，缺血組按上述模型建立

3、，然后轉(zhuǎn)入正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)3h、6h、12h分別取出細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)組在類缺血再灌注模型基礎(chǔ)上于缺血前加入終濃度為45μg/L的前列地爾。4、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測UCP4的表達(dá)：取出生長有神經(jīng)細(xì)胞的蓋玻片，經(jīng)冷凍的無水酒精固定，用UCP4-抗按SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。5、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析、SNK法檢驗(yàn)及兩因素相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)

4、果：通過原代神經(jīng)元培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)出了可供實(shí)驗(yàn)的原代神經(jīng)元，并在此基礎(chǔ)上成功建立了類缺血再灌注模型。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示類缺血再灌3h時UCP4的表達(dá)即降低，隨著時間延長，其表達(dá)持續(xù)降低，與正常組比較在各時間點(diǎn)上均有差別(P<0.05)，尤以再灌后6h、12h時降低明顯(P<0.01)。對細(xì)胞內(nèi)活性氧，在再灌注3h、6h、12h三個不同時間點(diǎn)ROS亦隨時間在增加，與正常組比較在各時間點(diǎn)上均有差別(P<0.05)。UCP4的表達(dá)與ROS量

5、行相關(guān)分析顯示二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.745，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組(前列地爾干預(yù)組)在再灌后不同時間點(diǎn)UCP4的表達(dá)較類缺血再灌組均升高，同時ROS的含量亦降低(P<0.05)。與正常組比較在再灌后不同時間點(diǎn)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論：UCP4在類缺血再灌注后不同時間點(diǎn)的表達(dá)呈動態(tài)變化，在再灌注3h時UCP4的表達(dá)即降低；再灌注6h時UCP4的表達(dá)明顯降低，再灌注12h時其表達(dá)仍在下降，提示了UCP4可能參與了