KIR基因型對異基因造血干細(xì)胞移植結(jié)果的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、殺傷細(xì)胞的免疫球蛋白樣受體(Killercellimmunoglobulin—likereceptor，KIR)是主要表達(dá)于人NK細(xì)胞及部分T細(xì)胞表面的一類受體。編碼KIR的基因位于人19號染色體(19q13.4)，該基因家族包括15個基因和2個假基因[16]。KIR家族基因呈現(xiàn)高度遺傳多態(tài)性，不同種族間KIR基因型的分布存在著很大的差異。依照KIR基因數(shù)量和種類，人類KIR主要分為兩種單倍型：A和B。KIR主要通過與靶細(xì)胞表面的HIA

2、Ⅰ類分子結(jié)合，傳遞抑制或活化信號，從而調(diào)控NK細(xì)胞的功能。在抗感染免疫、腫瘤免疫、清除老化變異細(xì)胞、造血干細(xì)胞移植以及自身免疫性疾病等領(lǐng)域發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 異基因造血干細(xì)胞移植(allo—HSCT)是治療多種惡性病及一些非惡性病的有效方法，尤其在治療急性白血病方面，可使50％以上患者長期無病生存。但allo—HSCT治療就像一把雙刃劍，在有效發(fā)揮造血重建、移植物抗白血病(GVL)等作用的同時，也會出現(xiàn)一些嚴(yán)重的并發(fā)癥而導(dǎo)致病

3、人死亡。引起病人死亡的主要原因是移植物抗宿主病(GVHD)和移植后復(fù)發(fā)。因此，如何減少GVHD和防止復(fù)發(fā)成為異基因造血干細(xì)胞移植迫切需要解決的關(guān)鍵問題。 動物實(shí)驗和臨床觀察提示allo—HSCT后，由KIR—配體不相合引起的NK細(xì)胞異源反應(yīng)性能通過釋放多種促造血因子促進(jìn)骨髓植入和造血重建，通過殺傷受者來源的抗原遞呈細(xì)胞(APC)從而阻止T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD，同時由于活化NK細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，因此還能增強(qiáng)GVL效應(yīng)，避免移

4、植后復(fù)發(fā)。這一重大發(fā)現(xiàn)提示KIR不相合所引起的異源反應(yīng)性NK將為從根本上解決骨髓移植中GVHD和GVL的矛盾問題帶來新的希望。 上述現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于半相合移植[1]，而后研究提示在HLA相合的親緣或非親緣移植中均有發(fā)現(xiàn)[2，17]．但也有研究發(fā)現(xiàn)，KIR—配體不相合引起的NK細(xì)胞異源反應(yīng)性與TRM升高及總存活率下降有關(guān)[4,5]，故在這方面的研究仍是熱點(diǎn)，仍存在許多爭議。目前國內(nèi)關(guān)于KIR的臨床研究較少，我們將探討KIR基因型對異

5、基因造血干細(xì)胞移植的影響及抑制性KIR功能修飾后對NK細(xì)胞功能的影響，并研究KIR的人群分布情況。研究共分為3章： 第1章：在非親緣、親緣異基因造血干細(xì)胞移植中KIR與HLA基因型對移植結(jié)果的影響 本研究第1章中分析KIR與HLA基因型對親緣及非親緣移植結(jié)果的影響。抽提供者與受者外周血或骨髓的DNA，并采用序列特異性印物PCR法(PCR—SSP)對其進(jìn)行KIR與HLA—C位點(diǎn)基因檢測。HLA—C位點(diǎn)分為兩組：C1組(基因

6、Cw1、3、7及8)和C2組(基因為Cw2、4、5及6)，HLA—B位點(diǎn)分為Bw4與Bw6。KIR2DL1的配體為HLA—C2，KIR2DL2/2DL3的配體為HLA—C1，KIR3DL1的配體為HLA—Bw4。供受者KIR—配體不相合指供者存在上述抑制性基因，而受者缺乏上述一個或一個以上的相應(yīng)配體。供者KIR可被分為三類基因型AA、AB及BB，研究時分為兩組：AA及Bx(AB和BB)[18]。 結(jié)果顯示，在無關(guān)供者移植的病人中

7、，KIR不相合與復(fù)發(fā)風(fēng)險減少密切相關(guān)(p=0.019；HR=0.329，95％CI0.131-0.830)，尤其是在髓系白血病病人，KIR不相合除了與復(fù)發(fā)的減少相關(guān)外p=0.003；HR=0.193，95％CI0.066-0.563)，還能改善5年總生存(p=0.031；HR=0.423，95％CI0.194-0.924)及無病生存(p=0.024；HR=0.445，95％CI0.221-0.897)，而在淋系白血病病人，KIR不相合對

8、移植結(jié)果沒有影響；供者KIR基因型為AA相對于Bx累積復(fù)發(fā)率更低，分別為12.9％與28.6％(p=0.024)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)供者KIR含有更多的激活性受體基因與移植后復(fù)發(fā)風(fēng)險增高密切相關(guān)(p=0.005；HR=1.463，95％CI1.123-1.906)；對髓系白血病病人來說，供者KIR基因中含有KIR2DS3，是個重要的預(yù)后危險因素：復(fù)發(fā)風(fēng)險增加(p=0.003；HR=5.045，95％CI1.746-14.575)，而且5年總生存

9、(p=0.006；HR=3.046，95％CI1.378-6.732)及無病生存(p=0.003；HR=2.919，95％CI1.430-5.959)降低。在親緣移植病人中，病人HLA—C位點(diǎn)為雜合型C1C2，Ⅱ—Ⅳ度aGVHD發(fā)生增高(p=0.032；HR=2.685，95％CI1.087-6.635)，在親緣髓系病人中，也有類似的結(jié)果(p=0.024；HR=4.178，95％CI1.206-14.475)。在親緣移植淋系白血病病人中

10、，供者含有激活性受體KIR2DS1基因與Ⅱ—Ⅳ度aGVHD密切相關(guān)(p=0.023；HR=11.86，95％CI1.415-99.432)。 第2章：中國華東地區(qū)漢族與臺灣漢族人群中KIR基因型和單倍型分布情況 本研究第2章中隨機(jī)選擇116名華東地區(qū)漢族與97臺灣漢族無血緣關(guān)系的健康志愿者作為研究對象，分析兩人群的KIR分布情況，以及對移植的影響。KIR檢測方法同第1章，并根據(jù)Hsu等[13]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因型和單倍型分析

11、。 結(jié)果顯示：這兩個人群能檢出所有目前已知的17個KIR基因，KIR2D14、KIR3DL2、KIR3DL和3KIR3DP1基因存在于所有個體中，基因頻率均為1.00。除了KIR3DS1與2DS4*003兩個基因頻率在這兩個人群間有顯著性差異外，其它KIR基因頻率都很類似，在華東地區(qū)漢族人群可檢測到35種基因型，在臺灣人群有29種。以(2，2)和(1，2)兩種基因型最為常見，在華東漢族人群中的頻率分別為23.6％與19.8％；而

12、在臺灣漢族分別為20.6％與24.7％。兩個人群均有10種基因型可同時在其它多個人群中檢測到，約占所有華東研究個體的65％，臺灣個體的71％。華東漢族人群的A單倍型頻率為68.1％，臺灣漢族A單倍型頻率為74.1％，均明顯高于B單倍型。每個人群均有4種基因型無法根據(jù)Hsu等[13]的標(biāo)準(zhǔn)模式分析出單倍型。 第3章：KIR功能修飾對NK細(xì)胞的功能影響 本研究第3章應(yīng)用單克隆抗體CD158a和CD158b封閉KIR兩個重要的

13、抑制性受體KIR2DL1與KIR2DL3后，對NK細(xì)胞的功能影響，進(jìn)一步去闡明KIR功能修飾后NK細(xì)胞實(shí)現(xiàn)GVL與GVHD分離的可能機(jī)制。應(yīng)用Rosettesep人NK分選試劑盒分選人外周血NK細(xì)胞，使用乳酸脫氫酶釋放法檢測NK細(xì)胞對不同白血病細(xì)胞(人腫瘤細(xì)胞株NB4、Raji細(xì)胞和K-562)及同種異體的成熟或未成熟的DC的殺傷活性，并觀察單克隆抗體封閉后，NK細(xì)胞殺傷活性的改變。應(yīng)用CCK-8試劑檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中NK細(xì)胞對T淋

14、巴細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用ELISA法檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中細(xì)胞因子TGF—β1的表達(dá)水平． 結(jié)果顯示，任何一個抗體封閉KIR后，NK細(xì)胞殺傷NB4活性均增強(qiáng)，并與抗體濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系(p＜0.05)，兩個封閉抗體聯(lián)用能增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性；對淋系白血病Raji細(xì)胞的殺傷活性則改變較小，僅0μg/ml組與20μg/ml組有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)；NK細(xì)胞本身對K-562細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷活性，但經(jīng)抗體封閉后，這種活性并沒有提高

15、?？贵w作用后，對NB4細(xì)胞克隆形成的抑制率增高，并與封閉抗體濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系(7.55％±4.43％vs．28.68％±2.31％，p＜0.05)。對同種異體未成熟DC具有一定的殺傷作用，但抗體封閉后，NK細(xì)胞的殺傷活性改變較小，各濃度組間沒有顯著性差異．成熟DC幾乎耐受NK細(xì)胞的殺傷，但經(jīng)抗體封閉KIR后，NK細(xì)胞對成熟DC的殺傷活性明顯增強(qiáng)，并與抗體濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系(2.20％±1.10％vs．37.59％±5.06％)，各組間比較

16、p＜0.05。經(jīng)抗體封閉后的NK細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中能明顯提高對T細(xì)胞的增殖抑制(77.85％±8.31％vs．43.05％±5.95％，p＜0.05)，檢測上清液中的細(xì)胞因子TGF—β1含量增加。綜上所述，本研究目前得出結(jié)論如下： 1)在非親緣造血干細(xì)胞移植后的髓系白血病病人，在GVH方向的KIR—配體不相合與移植后病人5年生存的改善密切相關(guān)，而且復(fù)發(fā)風(fēng)險也顯著降低。 2)在非親緣移植中，供者含有更多的KIR激活性

17、受體基因與病人的復(fù)發(fā)風(fēng)險增高密切相關(guān)；在髓系白血病病人，供者KIR中含有KIR2DS3是個預(yù)后不良的因素。 3)在親緣移植中，病人HLA—C位點(diǎn)為雜合型C1C2與aGVHD發(fā)生密切相關(guān)；在淋系白血病病人中，供者含有激活性受體KIR2DS1基因也與aGVHD發(fā)生密切相關(guān)。 4)華東地區(qū)漢族與臺灣漢族人群KIR基因分布表現(xiàn)出中國漢族人群KIR基因遺傳多態(tài)性的一些共同特點(diǎn)。 5)華東地區(qū)漢族與臺灣漢族人群KIR分布的部