β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶對斷奶仔豬生長軸激素的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、本課題以斷奶仔豬為試驗對象，通過飼養(yǎng)試驗、屠宰試驗、腺垂體細(xì)胞和肝臟細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗，從胃泌素(GAS）基因表達(dá)、生長激素(GH)和類胰島素生長因子I(IGF-I)基因表達(dá)、GH脈沖分泌模式、IGF-I血清水平及其它與生長相關(guān)的激素和血清生理生化指標(biāo)、內(nèi)源消化酶活性、大腸微生物區(qū)系等方面揭示在大麥型飼糧中添加β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶對斷奶仔豬生長軸激素的影響并闡明其機(jī)理，旨在為β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

2、r>　　 根據(jù)Genebank登錄的豬GAS、GH、IGF-I和內(nèi)標(biāo)β-actin基因序列設(shè)計引物，分別以胃竇組織、腺垂體組織和肝臟組織mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，克隆得到了相應(yīng)的GAS、GH、IGF-I和內(nèi)標(biāo)β-actin的基因片段。對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析表明，克隆得到的GAS、GH、IGF-I及內(nèi)標(biāo)β-actin基因序列與Genebank登錄的相應(yīng)基因片段（登錄號分別為NM_001004036、M22761、M31175

3、和U07786）同源性分別為100％、99.60％、100％和100％。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了PCR反應(yīng)中適宜的退火溫度、Mg2+濃度和循環(huán)數(shù)，構(gòu)建了適合相應(yīng)基因序列的優(yōu)化半定量RT-PCR法，以用于研究β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶對斷奶仔豬胃竇GAS、腺垂體GH和肝臟IGF-I基因mRNA表達(dá)量的影響，結(jié)果表明GAS、GH、IGF-I和β-actin退火溫度分別為62℃、62℃、61℃和60℃時，Mg2+濃度皆為1.5mmol/L、循環(huán)

4、數(shù)皆為29時條件最優(yōu)。
　　 選擇36頭“杜長大”三元雜交斷奶仔豬（公母各半，平均體重為13.10±1.38 kg，28日齡斷奶），按科學(xué)飼養(yǎng)試驗要求分為2組，分別飼喂不含和含有1.5 g/kgβ-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶的大麥型飼糧（大麥含量為65％），其中葡聚糖酶的活性為10000U/g，木聚糖酶活性為80000U/g，試驗預(yù)試期7d，正試期28d。飼養(yǎng)期間，試驗豬自由采食、飲水。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從試驗組和對照組的每個重復(fù)中各隨

5、機(jī)選取試驗豬2頭（公母各半），共12頭，飼喂相應(yīng)飼料，lh后，分別耳靜脈采血，試驗于10:00至13:00，每隔20min采樣一次，并分別制備血清，以研究β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶對仔豬GH脈沖分泌的影響。按常規(guī)方法進(jìn)行屠宰，并采集血清樣品、肝臟、垂體、胃竇和胰腺樣品、十二指腸、空腸、回腸和盲腸樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析。同時，通過體外原代培養(yǎng)豬腺垂體細(xì)胞和肝臟細(xì)胞，檢測GAS對GH和IGF-I分泌的影響。獲得了以下主要研究結(jié)果：
　　

6、 1.飼養(yǎng)試驗結(jié)果表明：添加β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶(1.5g/kg)使繼奶仔豬的日增重提高了13.99％（P<0.05），料重比降低了6.32％(P＜0.05)，日采食量有增加的趨勢，但差異不顯著（P>0.05)，并使腹瀉頻率降低了41.80％（P＜0.05）；
　　 2.血清生化指標(biāo)及與生長相關(guān)激素水平的分析表明：復(fù)合酶的添加使得斷奶仔豬血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和血清尿素氮含量分別降低了26.46％(P＜O.05)和21.27％(

7、P<0.01)，使血清總蛋白和葡萄糖含量分別增加了22.97％(P0.05）；還顯著提高了斷奶仔豬血清游離三碘甲腺原氨酸和胰島素水平，分別比對照組提高了43.42％(P<0.05)和32.07％(P0.05）。
　　 3.胃竇GAS mRNA豐度

8、和血清GAS水平分析表明：添加復(fù)合酶顯著上調(diào)了斷奶仔豬胃竇GAS的mRNA豐度和血清GAS水平，與對照組相比，分別提高了64.04％（P<0.01）和48.41％(P<0.01)。
　　 4.GH脈沖分泌、血清IGF-I水平及垂體GH和肝臟IGF-ImRNA豐度分析顯示：β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶(1.5g/kg)的添加，顯著提高了斷奶仔豬GH分泌的基礎(chǔ)水平、總體水平和峰強(qiáng)度，分別比對照組提高了27.27％(P<0.05)、34.

9、62％（P<0.05）和34.69％(P<0.05)，但對分泌頻率和峰持續(xù)時間未產(chǎn)生顯著性影響（P>0.05）：復(fù)合酶的添加還明顯上調(diào)了腺垂體GH和肝臟IGF-I的基因表達(dá)及血清IGF-I水平，比對照組分別提高了36.90％（P<0.05)、33.43％(P<0.01)和43.91％(P　　 5.體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗結(jié)果表明：在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為10-10Mol/L、10-8mol/L和10-6mol/L的五肽

10、胃泌素（pGAS，GAS的體外合成類似物）培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后，顯著促進(jìn)了體外原代培養(yǎng)的豬腺垂體細(xì)胞(P<0.05)和肝臟的細(xì)胞增殖（P<0.05），同時促進(jìn)了腺垂體細(xì)胞分泌GH（P

11、5)。
　　 6.內(nèi)源消化酶活性和消化器官形態(tài)分析表明：添加β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶對胰腺消化酶和胃蛋白酶活性有提高的趨勢，但無顯著性影響（P>0.05），使空腸粘膜麥芽糖酶、蔗糖酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性分別提高了103.33％(P<0.05)、145.35％（P<0.05）和94.74％（P

12、.33％（P＜0.05），并明顯改善了肝臟、胰腺、胃竇幽門腺和小腸粘膜絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使小腸絨毛高度增加且排列整齊，絨毛高度顯著增加(P<0.01)，隱窩深度降低（P<0.05）。
　　 7.盲腸內(nèi)容物菌群、細(xì)菌酶活性以及總短鏈脂肪酸(SCFA)濃度分析顯示：添加復(fù)合酶可顯著提高盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌(P<0.05)和雙歧桿菌（P<0.05）數(shù)量，降低沙門氏菌(P<0.05)和大腸桿菌數(shù)量（P<0.05），同時使細(xì)菌酶β-葡萄糖苷

13、酸酶的活性降低了23.38％（P<0.05），β-半乳糖苷酶活性提高了19.31％（P　　 本研究結(jié)果提示：
　　 飼料中添加β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶能顯著提高斷奶仔豬日增重和飼料利用效率；添加復(fù)合酶可上調(diào)胃竇胃泌素基因表達(dá)，顯著提高血清

14、胃泌素水平，明顯改善了幽門腺和腸粘膜絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)，并可顯著提高二糖酶活性；β-葡聚糖、木聚糖復(fù)合酶在飼料中的添加可上調(diào)腺垂體GH基因表達(dá)，明顯提高GH脈沖分泌；與此同時，還可上調(diào)肝臟IGF-I基因表達(dá)，顯著提高血清IGF-I水平；豬原代細(xì)胞培養(yǎng)表明：胃泌素能上調(diào)腺垂體細(xì)胞的增殖，顯著提高GH的分泌量；還可上調(diào)肝臟細(xì)胞的增殖，顯著增加IGF-I的合成量；添加復(fù)合酶可使盲腸內(nèi)容物微生物區(qū)系發(fā)生改變，其中乳酸桿菌和雙歧桿菌顯著增加，沙門氏菌和