中藥藥效物質(zhì)乳香酸及鞣花酸“化瘀解毒”治療血瘀證的作用及機制.pdf

1、中醫(yī)藥的應(yīng)用歷史悠久，一直在重大疾病的防治中發(fā)揮著不可替代的作用，其療效在國際范圍內(nèi)得到公認。中藥的研發(fā)和應(yīng)用在中國、德國、日本、印度發(fā)展迅猛，例如復(fù)方丹參滴丸、金納多、小柴胡湯等中藥制劑。近年來，心腦血管疾病嚴重損害人們身體健康、影響生活質(zhì)量，致死率逐年升高。腦卒中和動脈粥樣硬化是代表性心腦血管疾病，且動脈粥樣硬化是腦卒中的重要病理基礎(chǔ)。雖然西方醫(yī)學(xué)針對這兩類疾病的研究較多，但是目前仍缺少有效的治療方式，針對疾病單一靶點、單一發(fā)病環(huán)節(jié)

2、的藥物研發(fā)已進入了瓶頸期。而中醫(yī)治法治則強調(diào)對機體的整體調(diào)控、多靶點多層次防治疾病，這種理念已突顯出其獨特的優(yōu)勢。在中醫(yī)藥理論中，腦卒中以及動脈粥樣硬化病變病因歸結(jié)于“血瘀”，屬于中醫(yī)血瘀證的范疇。“化瘀解毒”中藥治療血瘀證在臨床上取得了明確的效果，有副作用少、藥物依耐性低等優(yōu)勢。然而，傳統(tǒng)中藥面臨著諸如成分不明確、機制不清楚、臨床安全性等問題，這些問題的解決是中醫(yī)藥得到突破性發(fā)展的關(guān)鍵。
　　已有研究證實，鞣花酸和乳香酸均為“化

3、瘀解毒”中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，兩者均是具有抗氧化活性的天然化合物并且有可能作用于Nrf2通路。乳香酸是“活血定痛”的中藥乳香的主要藥效成分，而鞣花酸廣泛存在于中藥石榴、赤芍、五倍子中。在傳統(tǒng)組方中乳香和包含鞣花酸的中藥常配伍合用。本課題中我們以血瘀證急性分型中的腦卒中和慢性分型中的動脈粥樣硬化疾病為研究模型；作用機制探討以經(jīng)典的抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/HO-1為主；在研究AKBA和KBA的神經(jīng)保護作用的實驗中，采用了大鼠腦缺血再灌注模型、

4、神經(jīng)行為學(xué)評價、細胞缺氧缺糖（OGD）模型、免疫組織化學(xué)、免疫印跡等技術(shù)。在研究EA對動脈粥樣硬化和血管內(nèi)皮功能障礙的作用中，使用了兩種高血脂小鼠模型和HVUECV細胞模型。實驗內(nèi)容分為以下兩個部分：
　　第一部分乳香藥效物質(zhì)AKBA和KBA抗腦缺血再灌注損傷的作用及機制研究
　　乳香酸 AKBA和KBA均是“化瘀解毒”中藥乳香樹脂提取物中主要的活性成分即藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于典型的五環(huán)三萜類化合物。本部分實驗?zāi)康氖茄芯?/p>

5、AKBA和KBA作為Nrf2誘導(dǎo)劑在腦缺血再灌注（I/R）損傷保護的作用及其機制，進行了器官、細胞、分子多層次多維度的研究。
　　在實驗一中，我們首先證實了AKBA在大鼠體內(nèi)腦I/R的保護作用。將所有SD大鼠隨機分為3組：Sham組，Vehicle+I/R組，以及AKBA+I/R組。建立SD大鼠大腦中動脈阻閉（MCAO）模型。于腦缺血再灌注48 h時間點，進行神經(jīng)功能行為學(xué)評價。而后處死大鼠，取腦對其TTC染色，計算腦梗死體積百分

6、率。評價腦組織中氧化指標及其Nrf2/HO-1的蛋白表達。在實驗二體外模型中，我們進一步研究AKBA的藥理學(xué)機制，以大鼠腦皮層神經(jīng)元細胞OGD模型模擬體內(nèi)的缺血再灌注過程。以MTT法表征細胞的存活率。通過siRNA抑制的方法研究Nrf2/HO-1通路在細胞保護中的作用。實驗結(jié)果如下：與損傷組相比，再灌注開始時間點注射給予AKBA，再灌注48 h時，可顯著降低腦梗死體積百分率、抗神經(jīng)細胞凋亡，同時誘導(dǎo)腦組織中Nrf2和HO-1蛋白的表達（

7、P<0.05）。在OGD模型中，AKBA同樣可以誘導(dǎo)Nrf2和HO-1蛋白的表達，并且保護細胞免受OGD的氧化損傷。AKBA顯著誘導(dǎo)Nrf2-ARE的結(jié)合活性（P<0.05）。然而，Nrf2和HO-1的敲除可以減弱AKBA介導(dǎo)的保護作用（P<0.05）。這些結(jié)果均表明，AKBA可以通過Nrf2/HO-1通路在腦I/R損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用以及抗氧化應(yīng)激作用。
　　本課題對乳香的另外一種藥效物質(zhì)乳香酸KBA的腦保護作用也進行了研究。

8、在實驗三中，體內(nèi)研究模型同樣采用的是雄性大鼠MCAO模型。在缺血再灌注1 h后給予KBA，于再灌注48 h后和損傷組進行比較，發(fā)現(xiàn)KBA顯著降低腦梗死體積，同時改善神經(jīng)功能評分。實驗結(jié)果證實給予大鼠KBA，能夠有效降低MDA水平，同時改善SOD的活性（P<0.05），以及調(diào)控誘導(dǎo)氧化還原通路Nrf2/HO-1。在原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞OGD模型中，我們同樣發(fā)現(xiàn)KBA具有抗氧化的細胞保護作用，并且通過siRNA實驗進一步證明了Nrf2/HO-

9、1機制在細胞保護中的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了KBA通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗I/R損傷的保護作用的結(jié)論。
　　第二部分鞣花酸基于Nrf2/HO-1通路抗動脈粥樣硬化及內(nèi)皮功能保護的作用
　　本部分實驗的目的是探討“化瘀解毒”中藥藥效物質(zhì)之一鞣花酸（EA）在防治內(nèi)皮功能障礙及動脈粥樣硬化中的作用及其維持氧化還原平衡的機制。在動物實驗中，模型選擇的是WT小鼠和Apoe?/?小鼠的高脂飲食模型進行藥效學(xué)評價，實驗分組均為

10、高脂飲食組（HFD）和高脂飲食加EA組（HFD+EA），持續(xù)時間為14周。各組小鼠的血管進行體外器官水平的血管舒張反應(yīng)性實驗。體外實驗選擇的是HVUECV的HOCl氧化損傷模型，對EA的抗氧化細胞保護作用進行評價。
　　實驗一結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨給予高脂飲食組相比，EA可以有效緩解動脈粥樣硬化的進程（P<0.05）。在體外器官水平的實驗二中，我們發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化模型的血管環(huán)中，EA可以顯著改善內(nèi)皮依賴的血管舒張功能以及緩解HOCl引

11、起的內(nèi)皮功能障礙（P<0.05）。另外，EA也可以顯著改善NO合成酶活性，以及血液抗氧化指標和內(nèi)皮功能標志物（P<0.05）。Western blot分析結(jié)果顯示，EA可以顯著誘導(dǎo)血管組織中Nrf2和HO-1的表達（P<0.05）。在實驗二中，我們發(fā)現(xiàn)EA可以保護來自于WT小鼠的血管免受氧化損傷，但是這種效果在Nrf2?/?小鼠的血管氧化模型中并不存在（P>0.05），提示 Nrf2在EA的抗氧化保護作用中是關(guān)鍵蛋白。在實驗三體外HVU

12、ECV細胞模型中，我們發(fā)現(xiàn)EA可以預(yù)防HOCl誘導(dǎo)的細胞損傷，同時明顯增強HO-1的表達（P<0.05）。然而，EA所發(fā)揮的細胞保護作用均被Nrf2-siRNA顯著抑制（P<0.05）。這些結(jié)果進一步證明了EA的由Nrf2介導(dǎo)的抗動脈粥樣硬化和內(nèi)皮功能改善作用。
　　本課題基于國科金（No.81373947）分別在兩部分實驗中探索血瘀證治療的潛在藥物、機制和靶點。以血瘀證為研究模型，以“化瘀解毒”中藥藥效物質(zhì)乳香酸和鞣花酸為工具藥