香蕉MADS-box基因的克隆、表達(dá)及與乙烯生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系研究.pdf

1、香蕉是世界上最重要的水果之一，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織定為世界第四大糧食作物。香蕉果實(shí)的采后成熟過(guò)程關(guān)系著香蕉的品質(zhì)和貨槳期的長(zhǎng)短，香蕉品質(zhì)和貨架期又直接影響到香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此研究香蕉采后成熟過(guò)程及調(diào)控對(duì)于香蕉品質(zhì)形成和發(fā)展改良創(chuàng)新采后保鮮和催熟技術(shù)具有重要意義. 通過(guò)對(duì)乙烯生物合成速率的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，香蕉采后的不同時(shí)期內(nèi)，乙烯的生物合成速率會(huì)發(fā)生一系列的變化。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從香蕉果實(shí)中克隆了香蕉采后果實(shí)成熟過(guò)程中乙烯生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵

2、酶基因：Ma-ACO1(登陸號(hào)AJ223232)和Ma-ACS1(登陸號(hào)AB021906)。選取正常成熟和乙烯誘導(dǎo)成熟兩種處理?xiàng)l件下處于不同成熟階段的香蕉果實(shí)，提取總RNA，采用熒光定量PCR的方法對(duì)Ma-ACO1和Ma-ACS1的表達(dá)量的變化進(jìn)行了研究，結(jié)合成熟乙烯生物合成的結(jié)果表明：Ma-ACS1直到系統(tǒng)2乙烯大量產(chǎn)生時(shí)表達(dá)量才顯著升高，是啟動(dòng)乙烯生物合成的關(guān)鍵酶，而Ma-ACO1在系統(tǒng)1基礎(chǔ)水平的乙烯生物合成中起作用并于乙烯峰時(shí)表

3、達(dá)量迅速提高。 乙烯作為植物激素發(fā)揮其調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的作用要通過(guò)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，其第一步就是乙烯與乙烯受體的結(jié)合。本研究首次利用熒光定量PCR方法，對(duì)香蕉中乙烯受體基因Ma-ETR(登陸號(hào)AF113748)在正常成熟和乙烯誘導(dǎo)成熟果實(shí)中的表達(dá)量的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，Ma-ETR基因表達(dá)變化可能受乙烯生物合成速率調(diào)節(jié)，而且推測(cè)其也受外源乙烯的誘導(dǎo)。 為在分子水平上深入了解香蕉果實(shí)采后成熟的機(jī)理，分離香蕉果實(shí)采后差異表達(dá)

4、基因就成為一種有效的手段。我們通過(guò)抑制縮減雜交和cDNA微陣列相結(jié)合的方法分離獲得了在香蕉成熟早期上調(diào)的一個(gè)MADS-box基因的cDNA片段。在此基礎(chǔ)上從香蕉果實(shí)cDNA文庫(kù)中，采用RT-PCR技術(shù)分離獲得一個(gè)全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)序列測(cè)定和同源性分析表明，該cDNA含705bp的完整的開放閱讀框，編碼234個(gè)氨基酸殘基的MADS-box蛋白，由于其是第二個(gè)從香蕉中克隆到的MADS-box基因，因此將其命名為MuMADS2(MusaMADS

5、-box2)。MuMADS2全長(zhǎng)1169bp，具有植物MADS-box基因家族中特有的M、I、K和C四個(gè)結(jié)構(gòu)域，與蘆筍、風(fēng)信子、蝴蝶蘭和百合的MADS-box基因的氨基酸序列存在很高的一致性(82％，78％，77％和75％)。將MuMADS2與其它植物來(lái)源的MADS-box基因進(jìn)行序列比較發(fā)現(xiàn)，MuMADS2屬于植物MADS-box基因的AGAMOUS亞族的D世系。 采用RT-PCR的方法對(duì)其在香蕉各器官的表達(dá)情況進(jìn)行分析表明，

6、MuMADS2僅在生殖器官(花和果)中表達(dá)，在營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖和葉)中不表達(dá)。而且在生殖器官中也具有組織特異性，即MuMADS2僅在雄花和雌花的子房、由雌花發(fā)育而成的果實(shí)中表達(dá)，而在雄花和雌花的柱頭和花柱都不表達(dá)。據(jù)此推測(cè)MuMADS2可能在果實(shí)的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起作用。 同樣采用熒光定量PCR的方法研究MuMADS2在正常成熟和乙烯誘導(dǎo)成熟的香蕉果實(shí)采后不同成熟階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在正常成熟的果實(shí)中，MuMADS2的表達(dá)

7、量在采后6d就達(dá)到了峰值，比成熟乙烯生物合成啟動(dòng)的時(shí)間提前了4天。隨后下降，到采后14d，乙烯生物合成達(dá)到最高值時(shí)，MuMADS2又有小幅的上升，隨之又急劇下降。這說(shuō)明很可能是MuMADS2表達(dá)量的升高誘導(dǎo)了成熟乙烯的生物合成。在乙烯誘導(dǎo)成熟的果實(shí)中，MuMADS2的表達(dá)量的升高發(fā)生在采后2d的果實(shí)中，而此時(shí)成熟乙烯的生物合成開始啟動(dòng)。隨后迅速下降，而當(dāng)成熟乙烯達(dá)到最大值時(shí)(8d)，MuMADS2的表達(dá)量也達(dá)到了最大值。這說(shuō)明，在乙烯誘

8、導(dǎo)成熟的果實(shí)中，MuMADS2表達(dá)量的變化可能受到乙烯的誘導(dǎo)而呈現(xiàn)出與正常成熟果實(shí)中所不同的表達(dá)方式，但MuMADS2表達(dá)的峰值在兩種處理?xiàng)l件下相差不大。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前進(jìn)行基因功能驗(yàn)證的有效手段，以pCAMBIA1302載體為基礎(chǔ)，將MuMADS2成功插入到35s啟動(dòng)子下游，GFP基因上游，構(gòu)建好的植物表達(dá)載體命名為pCAMBIA1302-MuMADS2，為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證功能工作奠定了基礎(chǔ)。 為研究MuMADS2的