過表達(dá)synoviolin促進(jìn)功能性滑膜形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.背景與目的
　　 肌腱損傷修復(fù)術(shù)后形成限制性粘連對(duì)手外科醫(yī)生而言是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。目前，臨床上通常使用無滑膜肌腱段作為移植材料修復(fù)屈肌腱缺損。但是，在愈合過程中通常都伴隨有術(shù)后粘連的發(fā)生。這主要是由于無滑膜肌腱表面沒有滑膜組織覆蓋。滑膜在肌腱愈合與粘連防治中發(fā)揮著重要的作用。它通過阻止外源性成纖維細(xì)胞的過度增生以及腱周組織與肌腱的接觸抑制了外源性愈合；滑膜分泌的滑液能促進(jìn)肌腱滑動(dòng)，減少摩擦，營養(yǎng)肌腱，增強(qiáng)肌腱的內(nèi)源性愈合。如

2、果能使易于取材的無滑膜肌腱表面形成滑膜組織，即無滑膜肌腱滑膜化，將對(duì)粘連防治起到巨大的作用。為此，我們一直在尋找簡單有效地?zé)o滑膜肌腱滑膜化方法。
　　 2003年，日本科學(xué)家在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種新基因synoviolin。它是一種E3泛素酶，含有RING-H2基序和六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解系統(tǒng)(ER-associated degradation)中發(fā)揮重要的作用。Synov

3、iolin在風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的滑膜細(xì)胞中表達(dá)增高，它通過抑制滑膜細(xì)胞凋亡使滑膜細(xì)胞過度生長和增殖。既然synoviolin能夠使滑膜細(xì)胞增殖，而無滑膜肌腱滑膜化可以有效地防粘連，如果將過表達(dá)synoviolin的滑膜細(xì)胞包裹在無滑膜肌腱周圍，將可能在肌腱表面形成一層滑膜，從而促進(jìn)肌腱的愈合并減輕粘連的發(fā)生。
　　 本課題的目的就是明確synoviolin對(duì)滑膜細(xì)胞的增殖作用，探討過表達(dá)synoviolin使無滑膜肌腱滑膜化的可行性

4、及有效性，為無滑膜肌腱滑膜化抗粘連提供簡單有效的方法。
　　 2.方法
　　 2.1.synoviolin慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)和synoviolin基因共表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，通過與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝生產(chǎn)慢病毒，經(jīng)超速離心濃縮收集病毒顆粒，采用轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的方法測定慢病毒功能滴度，為后續(xù)研究提供了高效的轉(zhuǎn)基因平臺(tái)。
　　

5、2.2.synoviolin在滑膜細(xì)胞的表達(dá)及對(duì)其增殖、HA分泌的作用
　　 采用酶消化法分離純化原代滑膜細(xì)胞，免疫組化染色對(duì)其進(jìn)行鑒定。慢病毒感染滑膜細(xì)胞后，RT-PCR和Western Blot檢測synoviolin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測synoviolin對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響，ELISA技術(shù)檢測過表達(dá)synoviolin后滑膜細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸的情況。
　　 2.3.synovio

6、lin促進(jìn)功能性滑膜形成的作用
　　 手術(shù)分離取出兔的無滑膜肌腱段，將Lenti-synoviolin和Lenti-lacZ感染的滑膜細(xì)胞分別與肌腱共培養(yǎng)，體外進(jìn)行無滑膜肌腱的滑膜化。HE染色和掃描電鏡觀察肌腱表面滑膜形成情況，切片細(xì)胞計(jì)數(shù)比較滑膜形成的速度，阿辛藍(lán)染色法檢測共培養(yǎng)形成的滑膜分泌透明質(zhì)酸的情況。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1.synoviolin慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 3.1.1.PC

7、R擴(kuò)增獲得含SallI和BamHI酶切位點(diǎn)的synoviolin目的基因片段；
　　 3.1.2.將目的基因連接到pMD18-T載體中進(jìn)行擴(kuò)增：
　　 3.1.3.經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟后得到真核表達(dá)載體pIRES2-synoviolin-egfp；
　　 3.1.4.雙酶切獲得synoviolin-egfp基因片段，將其克隆至pENTR1A的多克隆位點(diǎn)得到入門克隆pENTR1A-synoviolin-egfp

8、；
　　 3.1.5.利用Gateway技術(shù)的LR重組反應(yīng)將synoviolin-egfp基因片段轉(zhuǎn)入目的載體，獲得慢病毒表達(dá)載體pLenti4/TO/V5-DEST-synoviolin-egfp；
　　 3.1.6.將慢病毒表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝獲得慢病毒；
　　 3.1.7.超速離心濃縮收集病毒顆粒，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后通過熒光表達(dá)測定病毒滴度。Lenti-synoviolin的病毒滴

9、度為1×108TU/mL。
　　 3.2.synoviolin在滑膜細(xì)胞的表達(dá)及對(duì)其增殖、HA分泌功能的影響
　　 3.2.1.滑膜細(xì)胞的形態(tài)及鑒定
　　 原代培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞經(jīng)HE染色，普通光鏡下，細(xì)胞呈梭型或柱形，細(xì)胞核呈卵圓形位于細(xì)胞中央，核仁明顯。免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞對(duì)vimentin蛋白表達(dá)陽性，CD14、CD68蛋白表達(dá)陰性，說明該細(xì)胞來源于中胚層，并具有成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)，是滑膜細(xì)胞B型細(xì)胞，即

10、成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)。
　　 3.2.2.滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lenti-synoviolin后過表達(dá)synoviolin
　　 慢病毒感染滑膜細(xì)胞48h后，RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Lenti-synoviolin感染滑膜細(xì)胞后synoviolin基因的mRNA和蛋白水平均有顯著的增高。
　　 3.2.3.過表達(dá)synov

11、iolin促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖并改變其細(xì)胞周期
　　 采用MTT法分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染synoviolin48h后增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，G1期細(xì)胞比例小于對(duì)照(P<0.05)，S期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照(P<0.01)，細(xì)胞增殖指數(shù)高于對(duì)照(P<0.05)，提示過表達(dá)synoviolin對(duì)滑膜細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用。
　　 3.2.4.過表達(dá)synoviolin促進(jìn)滑膜細(xì)胞

12、HA分泌增加
　　 為了檢測synoviolin對(duì)滑膜細(xì)胞HA分泌能力的影響，我們使用兔透明質(zhì)酸ELISA試劑盒對(duì)感染Lenti-synoviolin的滑膜細(xì)胞進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染滑膜細(xì)胞后，細(xì)胞上清HA含量均有顯著升高，其中24h和48h(P<0.05)，72h(P<0.01)。提示過表達(dá)synoviolin有促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌HA的作用。
　　 3.3.synoviolin促進(jìn)功能性滑膜形成的作用
　　

13、 3.3.1.過表達(dá)synoviolin促進(jìn)滑膜的形成
　　 滑膜細(xì)胞感染Lenti-synoviolin或Lenti-lacZ后，分別與無滑膜肌腱體外共培養(yǎng)3天和7天后，HE染色和掃描電鏡觀察到肌腱表面可見細(xì)胞附著生長并形成細(xì)胞層。通過對(duì)肌腱表面的細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，過表達(dá)synoviolin組肌腱表面滑膜細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，提示過表達(dá)synoviolin能加速滑膜的形成
　　 3.3.2.共培養(yǎng)肌腱具有分泌HA

14、的功能
　　 滑膜細(xì)胞與無滑膜肌腱共培養(yǎng)3天后阿辛藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn)，Lenti-synoviolin和Lenti-lacZ組在0.06 M MgCl2濃度時(shí)染色均呈陽性，而在MgCl2濃度為1，2.61，3.56時(shí)，兩組染色均呈陰性。這個(gè)現(xiàn)象說明肌腱表面有細(xì)胞合成的酸性粘多糖(透明質(zhì)酸)存在，提示共培養(yǎng)肌腱具有分泌HA的功能。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1.過表達(dá)synoviolin促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖；