組織工程化模型探討異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)心臟瓣膜鈣化機制研究.pdf

1、第一部分組織工程化二葉瓣心臟瓣膜模型構(gòu)建及誘導(dǎo)鈣化效果評估
　　目的:構(gòu)建組織工程化心臟瓣膜,縫制三葉和二葉瓣瓣膜模型,組裝生物反應(yīng)器系統(tǒng)對模型進行流體力學(xué)刺激,獲得異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)瓣膜鈣化模型,評估建模效果并確定最佳建模條件。
　　方法:應(yīng)用四分枝枝化狀聚乙二醇(PEG)改性去細(xì)胞豬主動脈瓣,并共價鍵合RGD肽,獲得組織工程化心臟瓣膜。從正常瓣膜標(biāo)本分離培養(yǎng),得到原代人瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(huVICs)并鑒定。組織工程化瓣葉接種

2、huVICs后,縫于定制鈦鎳合金瓣架上,獲得三葉及二葉瓣瓣膜模型。應(yīng)用BWET人工心臟瓣膜脈動流檢測儀測定所縫制三葉瓣及二葉瓣模型的流體力學(xué)性能。應(yīng)用WT600-1F滾壓式蠕動泵和自制反應(yīng)腔組裝生物反應(yīng)器系統(tǒng),實驗分組為:三葉瓣零流量組(A),三葉瓣生理流量組(B),二葉瓣零流量組(C)和二葉瓣生理流量組(D)(n=4),分別干預(yù)14d后取出瓣葉,行掃描電鏡檢測及鈣化指標(biāo)檢測(ALP含量測定、Runx2/Cbfα-1免疫組化染色、von

3、Kossa染色)。
　　結(jié)果:所縫制的組織工程化三葉瓣模型開放完全,閉合緊密;二葉瓣模型閉合基本正常,開放則明顯受限。離體流體力學(xué)性能檢測顯示,在相同心率及心輸出量條件下,兩種瓣膜模型的平均動脈壓和返流百分比均無明顯差異(P>0.10),而二葉瓣的開口面積明顯小于三葉瓣組(P<0.001),其跨瓣壓差也顯著升高(P<0.001)。應(yīng)用生物反應(yīng)器對接種huVICs的兩種瓣膜模型進行流體力學(xué)刺激,14d后掃描電鏡檢測發(fā)現(xiàn):零流量狀態(tài)下

4、,A、C組huVICs生長狀態(tài)良好,單層覆蓋組織工程化瓣葉材料表面,胞間連接緊密,然而排列無極性。在生理流量刺激下,B組瓣葉表面huVICs仍為單層覆蓋生長,呈現(xiàn)明顯的平行于流體方向的極性排列,細(xì)胞形態(tài)基本正常。然而D組二葉瓣瓣葉表面的huVICs形態(tài)發(fā)生明顯變化,胞質(zhì)發(fā)出偽足,喪失排列極性,呈無序狀生長。A、B、C組瓣葉中ALP含量較低,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而D組ALP含量顯著升高(P<0.01)。Runx2免疫組織

5、化學(xué)染色結(jié)果顯示,四組瓣葉表面均有單層細(xì)胞附著生長,A、B、C組中表層細(xì)胞中染色呈陰性,D組中則見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Runx2陽性染色。vonKossa染色證實A、B、C組瓣葉樣本中無陽性染色,D組瓣葉細(xì)胞接種面散在鈣鹽沉積點,但分布較局限。
　　結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用組織工程化二葉瓣瓣膜和生物反應(yīng)器系統(tǒng)可以成功構(gòu)建異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)瓣膜鈣化模型。
　　第二部分TGF-β1/BMP-2信號通路在異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)組織工程化瓣膜鈣化中機制研究

6、r>　　目的:應(yīng)用組織工程化二葉瓣瓣膜模型,探索TGF-β1/BMP-2通路在異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)瓣膜鈣化中的激活程度。
　　方法:以第一部分所構(gòu)建的組織工程化二葉瓣模型為研究對象,按照生物反應(yīng)器填充工作液和有無流體力學(xué)作用,分為三組:A組:完全培養(yǎng)基,零流量;B組:完全培養(yǎng)基,生理流量;C組:完全培養(yǎng)基(含10ng/ml人重組TGF-β1),生理流量;每組三個模型(n=3)。于干預(yù)第3d,7d,14d取出各組瓣葉行鈣化程度評估(Ru

7、nx2蛋白westernblot檢測及ALP含量檢測),采用RT-PCR及westernblot方法檢測瓣葉組織中TGF-β1及BMP-2的mRNA及蛋白表達水平。
　　結(jié)果:ALP含量檢測和Runx2蛋白表達水平檢測顯示:異常力學(xué)刺激下B組鈣化指標(biāo)較A組明顯升高(P<0.05),C組在異常力學(xué)作用基礎(chǔ)之上加入外源性TGF-β1,瓣膜鈣化水平較B組進一步加重(P<0.05)。RT-PCR和westernblot檢測顯示:A組瓣葉T

8、GF-β1、BMP-2的mRNA和蛋白含量都保持在較低水平;B組瓣葉的兩種信號分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平明顯上調(diào)(P<0.05)。C組在鈣化程度加重的同時,BMP-2的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也明顯升高(P<0.05)。
　　結(jié)論:異常力學(xué)刺激下,組織工程化瓣葉在發(fā)生鈣化改變的同時,其huVICs中TGF-β1及BMP-2轉(zhuǎn)錄與翻譯水平均發(fā)生上調(diào)。添加外源性TGF-β1可加重瓣葉鈣化程度,并上調(diào)瓣膜中BMP-2表達。從而證實TGF-β1和BMP-

9、2可能處于同一條信號通路的上下游,且該通路參與介導(dǎo)異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)瓣膜細(xì)胞發(fā)生鈣化改變。
　　第三部分BMP-2基因沉默對異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)組織工程化瓣膜鈣化作用研究
　　目的:通過RNA干擾技術(shù)抑制huVICs中BMP-2表達,探討B(tài)MP-2下游信號分子在異常力學(xué)刺激誘導(dǎo)瓣膜鈣化過程中的可能作用。
　　方法:構(gòu)建BMP-2shRNA質(zhì)粒,LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染huVICs,檢測轉(zhuǎn)染效果。應(yīng)用BM

10、P-2基因沉默的huVICs、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染huVICs及正常huVICs分別制備組織工程化二葉瓣模型。根據(jù)種子細(xì)胞不同以及有無生物反應(yīng)器作用,將模型分為六組分別干預(yù):A組:正常細(xì)胞,零流量組;B組:正常細(xì)胞,生理流量組;C組:BMP-2基因沉默細(xì)胞,零流量組;D組:BMP-2基因沉默細(xì)胞,生理流量組;E組:空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,零流量組;F組:空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,生理流量組;每組三個模型(n=3)。于干預(yù)第3d,7d,14d取出各組瓣葉行鈣化

11、程度評估(Runx2蛋白westernblot檢測及ALP含量檢測),并檢測BMP-2相關(guān)通路蛋白(BMP-2、Smad1、Msx2)的mRNA及蛋白表達水平。
　　結(jié)果:BMP-2shRNA質(zhì)?？山?jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染huVICs并獲得較為滿意的轉(zhuǎn)染效果。經(jīng)ALP含量檢測和Runx2蛋白表達水平檢測證實,BMP-2基因沉默處理后瓣葉(D組)在異常力學(xué)作用下的鈣化程度較無力學(xué)刺激組有所升高,但其升高程度顯著低于B、F組(P<0.01)。

12、RT-PCR及westernblot檢測發(fā)現(xiàn),力學(xué)作用下瓣葉B、F組BMP-2、Smad1、Msx2的mRNA和蛋白含量均有顯著上調(diào)(較A、C、E組,P<0.001),而接種BMP-2沉默huVICs的D組瓣葉在異常力學(xué)作用下,BMP-2、Smad1轉(zhuǎn)錄、翻譯水平無顯著升高,其含量明顯低于同樣干預(yù)條件下B、F組水平(相比A、C、E組,P>0.05,相比于B、F組,P<0.01)。Msx2的mRNA及蛋白含量則仍有顯著升高(相比A、C、E