鏈酶親和素修飾的CdSe-ZnS量子點(diǎn)在食源性致病細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、量子點(diǎn)是一種新型的半導(dǎo)體納米晶體材料。作為一種熒光標(biāo)記探針,它展現(xiàn)出傳統(tǒng)熒光染料所沒(méi)有的許多光化學(xué)優(yōu)點(diǎn)。首先,量子點(diǎn)具有寬的吸收光譜,窄而對(duì)稱的發(fā)射光譜,可以實(shí)現(xiàn)單波長(zhǎng)同時(shí)激發(fā)不同量子點(diǎn);其次量子點(diǎn)光化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng),經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間光源照射熒光特性不受損失,抗光漂白性能強(qiáng);最后,雖然不同尺寸的量子點(diǎn)具有不同的熒光發(fā)射波長(zhǎng)(顏色),但是它們都具有良好方便的表面化學(xué)可修飾性,以及表面生物分子偶聯(lián)的靈活可兼容特性,能與生物活性分子進(jìn)行有效的偶聯(lián)。近年來(lái)

2、,量子點(diǎn)在基因分析、免疫分析、微生物檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。本論文的主要工作是將鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)分別引入到基因芯片技術(shù)與聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)之中,建立了鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)平臺(tái),同時(shí)探討了鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的影響作用。
　　具體研究工作如下:
　　1.應(yīng)用鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物的基因芯片檢測(cè)食源性致病細(xì)

3、菌檢測(cè)方法的建立
　　基因芯片技術(shù)具有高通量、高速度、高效率的檢測(cè)特征,為環(huán)境微生物的檢測(cè)鑒定提供了強(qiáng)有力的檢測(cè)工具。但是目前以熒光有機(jī)染料為主要標(biāo)記物的基因芯片技術(shù),存在檢測(cè)靈敏度低,重復(fù)性差等技術(shù)上的缺陷,主要限制性原因是,熒光有機(jī)染料存在很多缺陷(如,熒光強(qiáng)度不高、穩(wěn)定性差、易被光漂白)。
　　量子點(diǎn)是半導(dǎo)體納米材料,具有優(yōu)良的光學(xué)特性,本研究借助鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)的優(yōu)良熒光特性,將其與基因芯片技術(shù)

4、相互融合,建立了鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)平臺(tái),并將其應(yīng)用于食源性致病細(xì)菌的檢測(cè)之中。具體實(shí)驗(yàn)方法為,將細(xì)菌16SrDNA基因作為檢測(cè)的靶基因,設(shè)計(jì)合成食源性致病細(xì)菌的寡核苷酸檢測(cè)探針,應(yīng)用生物芯片點(diǎn)樣儀將氨基化寡核苷酸檢測(cè)探針點(diǎn)至于醛基化的載玻片上制備基因芯片;合成生物素化修飾的通用引物,借助PCR反應(yīng),將生物樣品標(biāo)記上生物素;將生物素化的生物樣品與制備好的基因芯片進(jìn)行雜交,然后應(yīng)用鏈酶親和素標(biāo)記的CdS

5、e/ZnS量子點(diǎn)與基因芯片進(jìn)行溫育,借助生物素-鏈酶親和素系統(tǒng),將鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記到生物素化生物樣品-寡核苷酸探針雜交復(fù)合物上。應(yīng)用生物芯片掃描儀檢測(cè)雜交信號(hào)。
　　將建立的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)平臺(tái),應(yīng)用到多種食源性致病細(xì)菌的快速檢測(cè)之中,結(jié)果表明該方法能夠有效區(qū)分Vibrio parahaemolyticus,Vibrio fluvialis,Yersinia ent

6、erocolitica,Proteus spp.,Staphylococcus aureus,Enterococcus faecalis,Campylobacter jejuni,Streptococcus hemolytic-β,Listeria monocytogenes,而Escherichia coli,Shigella spp.,Salmonella spp.作為一類(lèi)菌被檢出,展現(xiàn)了良好的檢測(cè)特異性。
　　敏感性指標(biāo)亦是

7、評(píng)價(jià)檢測(cè)技術(shù)的重要參數(shù)之一,目前提高檢測(cè)靈敏度可從以下方面進(jìn)行考慮:選用性質(zhì)優(yōu)良的標(biāo)記物與采用優(yōu)良的信號(hào)放大方法。其中標(biāo)記物的性質(zhì)是決定靈敏度高低的主要因素,優(yōu)良的標(biāo)記物質(zhì)應(yīng)具有安全,靈敏,即不具有放射性,發(fā)光效率高,并且化學(xué)性質(zhì)應(yīng)較為穩(wěn)定,標(biāo)記方法簡(jiǎn)便,發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定長(zhǎng)久便于檢測(cè)。而在目前的標(biāo)記信號(hào)報(bào)告分子中,能夠同時(shí)符合以上要求的只有量子點(diǎn),因此本研究采用鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)作為基因芯片的熒光標(biāo)記物,提高基因芯片檢測(cè)

8、技術(shù)的靈敏性。同時(shí)在本研究中,引入了生物素-鏈霉親和素信號(hào)放大系統(tǒng),來(lái)配合量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)提升基因芯片的靈敏度,研究發(fā)現(xiàn),量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)方法的檢測(cè)敏感性為10cfu/ml,較熒光有機(jī)染料標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)方法有所提升。并且量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片技術(shù)重復(fù)性良好。
　　為了評(píng)估量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片技術(shù)在實(shí)際樣品中的應(yīng)用能力,我們將該方法應(yīng)用于32株從不同食品樣本中分離的菌株,進(jìn)行檢測(cè)鑒定,同時(shí)將檢測(cè)結(jié)果,與常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較

9、,二者的符合率達(dá)到100％。
　　該檢測(cè)方法對(duì)于病原菌的檢測(cè)鑒定能夠在7-8h內(nèi)完成。本研究建立的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)思路同樣適于其它致病微生物的檢測(cè),為利用量子點(diǎn)標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)鑒定致病微生物奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
　　2.鏈霉親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的影響
　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)是現(xiàn)代生

10、物學(xué)中非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù),自從1983年發(fā)明以來(lái),它已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的重要研究工具,促進(jìn)了生命科學(xué)研究的發(fā)展,在其發(fā)展過(guò)程中,研究者不斷對(duì)其擴(kuò)增效果進(jìn)行改進(jìn),目前,納米材料被引入PCR體系中,改善其反應(yīng)效果。
　　量子點(diǎn)是半導(dǎo)體納米材料,由于其具有出色的光學(xué)性能,而備受關(guān)注,但是,目前對(duì)量子點(diǎn)的其它特性,例如其表面基團(tuán)及分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)效應(yīng)關(guān)注不多,我們率先將鏈酶親和素修飾的量子點(diǎn)引入到PCR擴(kuò)增體系中,研究其對(duì)PCR反應(yīng)效果的

11、影響。
　　本部分研究借助PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù),研究鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)于PCR反應(yīng)的影響作用。觀察不同濃度的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)PCR特異性的影響;同時(shí),將特定濃度的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)加入到PCR體系中,觀察其對(duì)退火溫度的影響;將牛血清白蛋白(BSA)加入到含有一定濃度鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)的反應(yīng)體系中,觀察其對(duì)PCR擴(kuò)增效能的影響;同時(shí)將不同

12、公司來(lái)源的Taq酶加入到含有一定濃度的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系中,觀察相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一定濃度范圍內(nèi)的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)可以促進(jìn)PCR的擴(kuò)增效果,拓寬退火溫度,增強(qiáng)PCR的擴(kuò)增能力;超過(guò)一定濃度的鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)抑制PCR的擴(kuò)增效果;BSA能夠逆轉(zhuǎn)鏈酶親和素修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)于PCR的作用;當(dāng)使用不同公司來(lái)源的TaqDNA聚合酶