桑黃抗氧化活性成分的篩選及基分離純化.pdf

1、桑黃(Phellinus sp.),俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等,是擔(dān)子菌亞門層菌綱多孔菌目多孔菌科針層菌屬的一種珍貴的藥用真菌。子實(shí)體入藥最佳,味微苦,能利五臟、排毒、活血等。文獻(xiàn)報(bào)道,桑黃子實(shí)體具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗誘變功能、降血糖等活性。特別是桑黃的抗氧化活性引起人們的關(guān)注,本論文對(duì)不同品種、不同培養(yǎng)方式得到的桑黃原料中的抗氧化活性成分進(jìn)行了篩選、分離、純化及體外抗腫瘤和修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的生物活性研究。本論文的研究結(jié)果對(duì)了解桑黃抗氧化

2、的活性成分及開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品有一定的理論參考價(jià)值。本論文分四個(gè)部分,主要研究結(jié)果如下:
　　 1、比較不同品種桑黃子實(shí)體化學(xué)成分和生物活性的差異,篩選出抗氧化活性較高的品種
　　 以具有抗氧化活性的多糖和黃酮為主要指標(biāo),通過比較八種桑黃子實(shí)體多糖和黃酮含量差異及生物活性的高低,選取優(yōu)良品種進(jìn)行活性物質(zhì)的分離純化研究。采用水提醇沉法提取了八種不同桑黃子實(shí)體的粗多糖,測(cè)定了八種桑黃粗多糖中多糖和蛋白質(zhì)含量,分析了其單糖組成和氨基

3、酸成分,同時(shí)對(duì)八種桑黃粗多糖清除活性氧自由基和刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行來(lái)的檢測(cè)。結(jié)果表明,八種桑黃水提醇沉物中多糖和蛋白質(zhì)的含量有較大差異,單糖組成、氨基酸種類和含量也存在有一定的差異,其中PB-10的多糖得率(2.9％)和多糖含量(48.3％)較其他七種桑黃高,且PB-10粗多糖清除活性氧自由基能力也最高,其清除超氧陰離子、羥基、H2O2自由基的IC50值分別為0.45±0.13mg／mL,20.52±4.76μg／mL,16.47

4、±1.53μg／mL。體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PB-10和JSH粗多糖在50μg／ml濃度時(shí)淋巴細(xì)胞的增殖率為286.84％。
　　 PB-10子實(shí)體70％乙醇提取物的體外抗氧化活性(超氧陰離子、羥基、H2O2自由基的清除)實(shí)驗(yàn)表明,其清除超氧陰離子、羥基自由基以及H2O2的IC50值分別為11.13±2.32μg／mL,、0.53±0.13μg／mL和1.38±0.97μg／mL,較桑黃粗多糖有更好的抗氧化活

5、性。
　　 2、比較了培養(yǎng)方式對(duì)桑黃化學(xué)成分及抗氧化活性的影響
　　 通過比較同一桑黃菌株的發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體和人工栽培子實(shí)體中的黃酮類物質(zhì)含量及其抗氧化活性發(fā)現(xiàn)人工栽培桑黃子實(shí)體醇提物中黃酮的含量(52.42％)高于發(fā)酵菌絲體醇提物黃酮含量(16.74％)；其抗氧化活性(清除超氧陰離子、H2O2、DPPH的IC50值分別為34.65±8.91μg／ml、4.71±0.91ng／ml、8.18±1.14g／ml)能力均明顯高

6、于發(fā)酵菌絲體(清除超氧陰離子、H2O2、DPPH的IC50值分別為56.67±11.41μg／ml、7.65±0.49ng／ml、15.90±3.32g／ml)。對(duì)椴木栽培一年生、兩年生桑黃子實(shí)體醇提物、水提物中黃酮、三萜、多糖含量及其抗氧化(還原力測(cè)定、H2O2和DPPH的清除)、體外細(xì)胞免疫活性進(jìn)行了分析比較,結(jié)果表明,一年生桑黃子實(shí)體的黃酮、三萜和多糖的含量略高于兩年生桑黃；抗氧化活性優(yōu)于兩年生桑黃。
　　 3、桑黃子實(shí)體

7、抗氧化活性成分的分離純化及結(jié)構(gòu)分析
　　 采用四種不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)桑黃乙醇提取液依次萃取得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和醇水相。對(duì)五種萃取相分別進(jìn)行了清除NO自由基、超氧陰離子、羥基自由基、H2O2自由基、DPPH自由基,還原力測(cè)定以及抗脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙酸乙酯相在清除超氧陰離子、羥基、H2O2及DPPH自由基實(shí)驗(yàn)中的IC50值分別為2.98±0.01μg／ml、0.041±0.001μg／ml、0

8、.24±0.07μg／ml、3.89±0.02μg／ml,高于其它萃取相；并且乙酸乙酯相還具有較強(qiáng)的還原力和抗脂質(zhì)過氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)五種萃取相的抗氧化活性與其黃酮含量有一定的相關(guān)性。
　　 用硅膠、Sephadex LH-20和聚酰胺等對(duì)抗氧化活性較高的乙酸乙酯相繼續(xù)進(jìn)行分離純化,經(jīng)過柱層析和重結(jié)晶反復(fù)純化,得到4個(gè)單一化合物:PB-EA-1、PB-EA-2、PB-EA-3、PB-EA-4。對(duì)純化后的樣品進(jìn)行1HNMR,13C

9、NMR,DEPT,1H-1HCOSY,HMQC等波譜分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù),鑒定出化合物PB-EA-3化學(xué)式為C25H18O9,其被命名為Inoscavin A
　　 4、分離純化組分的抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的活性
　　 對(duì)PB-EA-2、PB-EA-3、PB-nB三種樣品進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn),并通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和修復(fù)損傷神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察有抗氧化活性組分的其他藥理活性。研究表明,PB-EA-3較乙酸乙