豬的一個喹賽多作用相關(guān)新基因的功能研究.pdf

1、喹賽多作為新一代喹噁啉類抗菌促生長劑，不僅保留了喹噁啉類藥物的廣譜抗菌和促生長雙重作用，與其他同類藥物相比還具有安全性高、用藥后吸收快、消除迅速、殘留期短等優(yōu)點。本實驗室于瑞同學(xué)通過mRNA差異顯示技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼喂喹賽多后，肝臟組織中有八條差異基因，其中一條基因在人和小鼠的數(shù)據(jù)庫中末檢索到與其同源的基因和蛋白質(zhì)，該基因的功能完全未知。崔文龍運(yùn)用3'RACE和5'RACE技術(shù)獲得新基因全長的cDNA序列。在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫中

2、檢索發(fā)現(xiàn)，該基因具有種屬特異性，位于豬的第11號染色體上，屬于非編碼RNA。目前，該基因的功能尚未被揭示，在喹賽多促進(jìn)動物生長的分子作用機(jī)制中扮演的角色也不明了。因此，本文從以下幾方面探索新基因的功能，并初步分析喹賽多作用可能的分子機(jī)制。
　　1、新基因超表達(dá)及其相關(guān)基因表達(dá)變化
　　將目的基因的全長(簡寫為CyaR)和可能的功能片段(簡寫為HFA)插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，獲得重組表達(dá)載體pcDNA3.1

3、(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA，測序結(jié)果表明插入的片段未發(fā)生突變，說明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　用LipofectamineTM2000試劑將重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA轉(zhuǎn)染至豬腎細(xì)胞PK-15，采用RT-qPCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中新基因RNA表達(dá)量，轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化至最佳。轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體之后，利用RT-qPCR檢測細(xì)胞中6個基因的表達(dá)變化情況，包括與脂肪代謝、免

4、疫應(yīng)答、蛋白質(zhì)代謝及其他功能相關(guān)的基因，如APOA-Ⅰ，CRBP-Ⅰ，F(xiàn)ABP5，CALCB，F(xiàn)BXO32，F(xiàn)MO3。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA的PK-15細(xì)胞中APOA-I，CRBP-Ⅰ，F(xiàn)ABP5，CALCB mRNA上調(diào)表達(dá)，F(xiàn)BXO32，F(xiàn)MO3 mRNA下調(diào)表達(dá)。
　　2、新基因沉默及其相關(guān)基因的表達(dá)變化
　　設(shè)計并合成新基因特異性siRNA，用Lipofe

5、ctamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞中，siRNA轉(zhuǎn)染條件經(jīng)RT-qPCR檢測優(yōu)化至最佳，其中siRNACyaR-sus-11可以明顯抑制新基因的表達(dá)，與陰性對照組相比，抑制率可達(dá)87％左右。siRNA轉(zhuǎn)染后，利用RT-qPCR檢測PK-15細(xì)胞中APOA-Ⅰ，CRBP-Ⅰ，F(xiàn)ABP5，CALCB，F(xiàn)BXO32，F(xiàn)MO3等基因的表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新基因的表達(dá)后，這些基因的表達(dá)量變化趨勢和新基因超表達(dá)后的情況相反。<

6、br>　　3、新基因的定位
　　設(shè)計合成以FITC標(biāo)記的特異性探針，利用RNA FISH技術(shù)檢測正常的PK-15細(xì)胞中新基因RNA的位置，結(jié)果顯示新基因的RNA絕大部分都分布在細(xì)胞質(zhì)中，預(yù)示著該基因在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　4、新基因超表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響
　　將構(gòu)建成功的兩個重組超表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染至PK-15

7、細(xì)胞中，用實時細(xì)胞分析儀(RTCA)實時監(jiān)測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)相比，新基因的部分片段和全長都可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，其中全長序列的促進(jìn)作用略強(qiáng)。
　　5、與新基因RNA相互作用的蛋白質(zhì)初步篩選
　　采用RNA pull down實驗技術(shù)，將基因全長CyaR的RNA在體外用生物素標(biāo)記，并和磁珠孵育過夜。PK-15細(xì)胞蛋白裂解液與磁珠-RNA共同孵育，將已孵育的磁珠-RNA-蛋白混合物低速離

8、心，上清回收，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，質(zhì)譜鑒定蛋白條帶。篩選出來EZH2和核仁素可能與新基因的RNA結(jié)合。
　　新基因可能通過與EZH2結(jié)合，招募染色體修飾復(fù)合物PRC2，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。同時，新基因可能通過與核仁素的相互作用，影響核仁素的水解和磷酸化水平，從而影響核仁素對核糖體的生物合成以及對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)功能，調(diào)控細(xì)胞的增殖。
　　綜上所述，新基因是位于細(xì)胞質(zhì)中的非編碼RNA，可能通過與蛋白質(zhì)EZH2結(jié)合調(diào)節(jié)基因