一個新的肺纖維化相關的α-SMA基因轉錄激活子—HMG1的克隆與初步功能研究.pdf

1、目的：哮喘氣道重塑、肺間質纖維化以及其它許多纖維化性疾病的一個共同病理過程就是表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌纖維母細胞的異?；罨c增多。研究α-SMA表達調控，這對于揭示纖維化相關疾病的發(fā)病機制將具有十分重要的意義。然而迄今為止人們對α平滑肌肌動蛋白表達的轉錄調控機制仍了解甚少，還有許多重要的轉錄因子和反應元件尚未被發(fā)現(xiàn)和揭示。我們在前期的研究工作中利用核酸-蛋白親和層析方法篩選到了一個屬于高遷移率蛋白家族-1(HMG-B1)成

2、員的，可能參與α-SMA啟動子活化的蛋白-HMG-1。本研究主要探討了HMG-1作為轉錄因子參與調控α-SMA基因轉錄的可能性，以及對α平滑肌肌動蛋白表達的影響。 方法：1、構建α-SMA啟動子紅色熒光報告質粒。 2、提取小鼠肺組織的總RNA用RT-PCR方法克隆HMG-1序列并將其亞克至真核表達載體pcDNA3.O和綠色熒光報告載體pEGFP-N2上。 3、將α-SMA啟動子紅色熒光報告質粒和HMG-1真核表達

3、載體質粒共轉染到3T3細胞和16HBE細胞中觀察過表達HMG1對α-SMA啟動子活化的影響。 4、用RT-PCR檢測轉染HMG1真核表達載體細胞中α-SMA基因轉錄水平。 5、建立博萊霉素致肺纖維化的小鼠動物模型，應用HMG1RNAi干擾HMG1的表達，Westernblot檢測α-SMA蛋白表達水平。 6、電泳遷移率分析(EMSA)檢測HMG1和α-SMA啟動子CArGA序列特異性的結合。 結果：1、酶

4、切鑒定及測序結果證實成功構建了α-SMA啟動子紅色熒光報告質粒pDsRed-SMA，HMG-1綠色熒光報告質粒pEGFP-N2-HMG1及pcDNA3.0-HMG質粒。 2、轉染pEGFPn2-HMG的16HBE細胞，綠色熒光蛋白的表達主要定位于細胞核，與轉染空載體pEGFPn2的細胞明顯不同。RT-PCR結果證實轉染細胞能夠表達外源HMG基因。 2、共轉染pDsRed-SMA啟動子紅色熒光報告質粒和pcDNA3.O-H

5、MG真核表達質粒顯示：細胞過表達HMG-1能夠活化α-SMA啟動子。轉染pcDNA3.O-HMG質粒的16HBE細胞顯著增加α-SMA基因轉錄。 3、Westernblot結果顯示博萊霉素致纖維化小鼠肺組織HMG1表達較同期正常對照小鼠顯著增加，相應α-SMA水平亦較正常小鼠增加，應用HMG1RNAi治療的纖維化小鼠肺組織HMG1表達被下調，與此亦同樣觀察到α-SMA水平下降。 結論： 1、初步證明我們在博萊霉素