一個(gè)新的鎘應(yīng)答原癌基因的致癌機(jī)制研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文一個(gè)新的鎘應(yīng)答原癌基因的致癌機(jī)制研究姓名：雷毅雄申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指導(dǎo)教師：陳學(xué)敏20060401華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士研究生畢業(yè)論文關(guān)細(xì)胞癌基因表達(dá)的影響，及其在鎘、鎳誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的變化情況，為致癌金屬鎘等毒物的人類(lèi)分子致癌機(jī)制提供新的依據(jù)，對(duì)于利用TEF16的表達(dá)改變作為金屬化學(xué)致癌新的分子生物標(biāo)記物的研究也具有較高的價(jià)值和前景。2方法：21TEF16表達(dá)質(zhì)

2、粒與細(xì)胞轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)的建立在TEF16cDNA起始密碼子的5端添加核苷酸序列5CACC3’，同時(shí)去掉cDNA核苷酸序列末端的蛋白表達(dá)終止密碼子。經(jīng)修飾的TEF16的開(kāi)放閱讀框架與表達(dá)載體pcDNA31N5His—TOPO的V5epitopeand6XHistag融合，構(gòu)建成TEF一16表達(dá)質(zhì)粒，再以限制性?xún)?nèi)切酶確認(rèn)。應(yīng)用磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO和COS7細(xì)胞，經(jīng)(418篩選后用Westernblot技術(shù)分析融合蛋白質(zhì)的

3、表達(dá)。因?yàn)門(mén)EF16編碼的蛋白與表達(dá)載體V5epitopeand6His所編碼的蛋白融合，所以這一融合蛋白質(zhì)可用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒中的V5epitope抗體與之起交叉反應(yīng)而被檢測(cè)。22TEF16轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及其惡性鑒定應(yīng)用磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，再用Westernblot技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒分析轉(zhuǎn)染物在細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)不超過(guò)6周，每周只換2次DME

4、M培養(yǎng)液。當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)化灶時(shí)終止培養(yǎng)，以亞甲基藍(lán)染色，觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。同時(shí)對(duì)TEF15轉(zhuǎn)染介導(dǎo)NIH3T3轉(zhuǎn)化細(xì)胞株進(jìn)行軟瓊脂集落形成試驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，以鑒定其惡性。23反義TEF18表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)把TEF16cDNA以反義方向(3’一5’)亞克隆于表達(dá)質(zhì)粒pcDNA31，、，5HisTOPO或pCIneoMammalianExpressionVector，構(gòu)建2種反義TEF16表達(dá)質(zhì)粒，并以限制性?xún)?nèi)切

5、酶確認(rèn)。聯(lián)合轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)就是觀察反義TEF16表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)聯(lián)合轉(zhuǎn)染Nq／13T3細(xì)胞可否抑制TEF16編碼蛋白表達(dá)。在各實(shí)驗(yàn)組中，隨機(jī)選取l瓶細(xì)胞進(jìn)行Westernblot分析以觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的瞬時(shí)表達(dá)，并用透光掃描軟件進(jìn)行半定量；同時(shí)將其余平行細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，分析各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。24反義TEF1／imRNA逆轉(zhuǎn)鎘轉(zhuǎn)化細(xì)胞致癌性的試驗(yàn)將反義TEF16表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CdCh轉(zhuǎn)化BALB／c3T3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，構(gòu)