生物毒素響應(yīng)智能水凝膠的構(gòu)建及其可視化定量檢測(cè)體系.pdf

1、生物毒素對(duì)人類(lèi)生命健康具有較大的威脅，高靈敏、高特異性的分析平臺(tái)亟待建立。目前，常用的分析平臺(tái)包括液相色譜、質(zhì)譜等儀器分析法，以及免疫分析法。前者雖然靈敏度高，但是分析儀器價(jià)格昂貴，且對(duì)操作者的專(zhuān)業(yè)技術(shù)水平要求較高，不適用于推廣至每個(gè)實(shí)驗(yàn)室或單位進(jìn)行檢測(cè);以ELISA為代表的免疫分析方法，具有較高的靈敏度和便攜、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但是受限于抗體的不穩(wěn)定性、批間差異大、難于制備等缺點(diǎn)。在建立檢測(cè)分析方法方面，核酸適體擁有與抗體相媲美的親和性的

2、同時(shí)又有許多優(yōu)勢(shì)，它具有合成簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、易于修飾、無(wú)免疫原性以及靶分子較為廣泛等諸多優(yōu)點(diǎn)，是潛在的抗體替代物。核酸適體智能水凝膠不僅可以進(jìn)行高靈敏、高特異性的檢測(cè)，還具有快速、便攜、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合需求現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的場(chǎng)合?；诤怂徇m體的智能水凝膠所建立的可視化定量檢測(cè)傳感器為生物毒素分析提供了新的發(fā)展方向，在生化分析毒素檢測(cè)領(lǐng)域顯示出極大的應(yīng)用前景。因此本論文圍繞生物毒素智能水凝膠，開(kāi)展了以下四方面的工作:
　　(1)赭曲霉素

3、A響應(yīng)的核酸適體水凝膠的制備與表征
　　OTA具有腎臟毒性、致癌、致畸以及抑制免疫力等危害人類(lèi)身體健康的毒性。我們選擇Cruz-Aguado小組篩選獲得的OTA aptamer（Aptamer1.12.2）為水凝膠的交聯(lián)劑，設(shè)計(jì)兩條與其互補(bǔ)的聚合單鏈，構(gòu)建了第一個(gè)生物毒素核酸適體水凝膠即OTA響應(yīng)的核酸適體水凝膠。首先，甲基丙烯基酰胺單體修飾的DNA根據(jù)自由基聚合的機(jī)理聚合為含有DNA鏈的線狀高分子聚合產(chǎn)物(PS-A和PS-B);

4、 PS-A和PS-B由于設(shè)計(jì)含有與OTA核酸適體部分互補(bǔ)序列，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，可以雜交成為三維網(wǎng)狀的水凝膠，并采用金顆?？梢暬姆椒▽?duì)水凝膠的成膠與刺激解膠進(jìn)行表征，初步獲得了可視化檢測(cè)OTA的靈敏度和選擇性。
　　(2)基于氣動(dòng)芯片和核酸適體水凝膠的赭曲霉素A的便攜定量檢測(cè)體系
　　基于金顆粒的可視化檢測(cè)方法雖然便攜，但是只能提供半定量或定性的分析結(jié)果，無(wú)法滿(mǎn)足精確定量的檢測(cè)需求，因而限制了其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。為了建立

5、既便攜又精確定量OTA檢測(cè)平臺(tái)，我們將一種氣動(dòng)芯片與包埋有催化能力的鉑包金顆粒水凝膠體系結(jié)合。作為一種信號(hào)讀出方式，氣動(dòng)芯片將OTA的濃度與氣體壓強(qiáng)相關(guān)聯(lián)。芯片內(nèi)部的顏色液體在氣壓的推動(dòng)下前進(jìn)的距離與OTA的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，又因預(yù)包埋的鉑包金顆粒有催化放大能力，進(jìn)一步降低水凝膠檢測(cè)限。并與OTA的免疫親和柱聯(lián)用，我們實(shí)現(xiàn)了啤酒樣品中痕量OTA的檢測(cè)，靈敏度為0.5μg/kg，滿(mǎn)足歐盟組織限定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)限(2μg/kg)。由此，我們成功建

6、立了基于水凝膠的OTA的可視化定量檢測(cè)體系。
　　(3)基于核酸適體的無(wú)標(biāo)記納米金可視化檢測(cè)黃曲霉毒素B1
　　黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前毒性最強(qiáng)的小分子真菌毒素，廣泛存在于糧食和畜禽飼料中，對(duì)人的生命健康造成極大的危害。因此對(duì)AFB1開(kāi)展有效的快速檢測(cè)具有重要的意義。基于無(wú)標(biāo)記金顆?？梢暬暮怂徇m體傳感器，具有便攜、快速等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。我們將本課題組篩選得到的AFB1核酸適體對(duì)高鹽體系中的金顆粒進(jìn)行保護(hù)，如

7、果溶液中存在AFB1，AFB1與核酸適體結(jié)合使得金顆粒脫保護(hù)而產(chǎn)生顏色變化，根據(jù)金顆粒溶液顏色的變化進(jìn)行可視化半定量檢測(cè)AFB1。雖然方法簡(jiǎn)便，但是體系的靈敏度較低，無(wú)法滿(mǎn)足AFB1實(shí)際樣品的檢測(cè)分析，所以需要對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)。
　　(4)黃曲霉素核酸適體的變構(gòu)篩選
　　無(wú)標(biāo)記金顆?？梢暬瘷z測(cè)AFB1存在體系穩(wěn)定性差、靈敏度低等缺陷，鑒于OTA響應(yīng)的核酸適體水凝膠及其可視化定量檢測(cè)體系的成功構(gòu)建，我們?cè)O(shè)想可以發(fā)展AFB1響應(yīng)