山楂種質(zhì)資源的分子鑒定及創(chuàng)新研究.pdf

1、山楂屬(Crataegus spp.)植物是重要的果樹種質(zhì)資源。本研究以原產(chǎn)于中國的山楂種質(zhì)資源為試材，探索建立并優(yōu)化山楂的RAPD分析體系和ISSR分析體系，在此基礎(chǔ)上，以在國家果樹種質(zhì)沈陽山楂圃保存的96份山楂屬植物資源為試材，利用RAPD標(biāo)記和ISSR.標(biāo)記對中國山楂屬植物的遺傳多樣性進行了分析。同時進行了山楂離體再生體系建立和四倍體誘導(dǎo)的研究。主要結(jié)果如下： 1.改進的CTAB法(提取緩沖液中含3％的CTAB)和QIAG

2、EN試劑盒法是適宜的山楂總DNA提取方法。改進的CTAB法提取的山楂總：DNA的產(chǎn)率較低，但是純度較高，OD<,260>/OD<,280>比值在1.638～1.889之間；QIAGEN試劑盒法提取的山楂總DNA的產(chǎn)率和純度均較高，供試8個樣品的總DNA產(chǎn)率均高于100μg/g，OD<,260>/OD<,280>比值在1.758～1.850之間。以改進的CTAB法和QIAGEN試劑盒法提取的山楂總DNA為模板進行RAPD和ISSR擴增，能

3、擴增出多條清晰的譜帶，多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。以SDS法提取的山楂總DNA為模板進行RAPD和ISSR擴增，未能擴增出譜帶。 2.對循環(huán)次數(shù)、反應(yīng)體系中Mg<'2+>濃度、DNA模板質(zhì)量、Taq DNA聚合酶的來源和濃度等多個影響RAPD反應(yīng)結(jié)果的因子進行了研究，首次建立了優(yōu)化的山楂屬植物RAPD分析體系，即：PCR反應(yīng)體積為20μl，內(nèi)含1×PCR反應(yīng)緩沖液(Promega)，2.0mmol/L MgCl<,2>，0.2

4、mmol/LdNTP(Promega)，0.3μmol/L引物，0.5 U Taq DNA聚合酶(Tiangen)，50 ng改進的CTAB法或QIAGEN試劑盒法提取的山楂總DNA；擴增程序為94℃30 s；94℃30 s，40℃2 min，72℃3 min，45循環(huán)，72℃7：min。根據(jù)譜帶的多少、多態(tài)性、清晰性，從146個RAPD引物中篩選出30個適宜于山楂屬植物遺傳分析的引物。 3.對退火溫度、循環(huán)次數(shù)、反應(yīng)體系中Mg

5、<'2+>濃度、DNA模板質(zhì)量、Taq酶的來源和濃度等影響ISSR反應(yīng)結(jié)果的因子進行了研究，首次建立了優(yōu)化的山楂屬植物ISSR分析體系，即：PCR反應(yīng)體積為20μl，內(nèi)含l×PCR反應(yīng)緩沖液(Promega)，3.0：mmol/LMgCl<,2>，0.2 mmol/L dNTP，0.3 μmol/L引物，0.5 U Taq DNA聚合酶(Tiangen)，50 ng改進的CTAB法或QIAGEN試劑盒法提取的總DNA；擴增程序為94℃3

6、 min；94℃30s，退火溫度(通過溫度梯度PCR篩選出的適宜溫度)1 min，72℃2 min，38循環(huán)，72℃7 min。根據(jù)譜帶的多少、多態(tài)性、清晰性，從36個ISSR引物中篩選出13個適宜于山楂屬植物遺傳分析的引物，其中有8個是基于(GA/CT)n或(AG/TC)n重復(fù)序列的在3’端加錨1～2個堿基的ISSR引物。 4.回收了1個山楂RA：PD多態(tài)性譜帶和16個ISSR多態(tài)性譜帶，然后對回收的譜帶進行克隆和測序，共獲得

7、了9個不同的山楂基因組序列?；诮馕龅纳介蛄性O(shè)計特異引物，成功地將1個RAPD標(biāo)記和5個ISSR.標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記。 5.首次利用分子標(biāo)記技術(shù)對山楂屬植物資源進行遺傳研究，表明山楂屬植物存在較高的遺傳多樣性。用12個RAPD引物在96份山楂屬植物資源上共檢測到136個多態(tài)性位點，不同山楂種質(zhì)資源之間的相異系數(shù)在0～0.73之間，UPGMA法聚類分析結(jié)果顯示不同山楂種質(zhì)資源之間距離系數(shù)在0～0.58之間；用13個ISSR引

8、物在96份山楂屬植物資源上共檢測到130個多態(tài)性位點，不同山楂種質(zhì)資源之間的相異系數(shù)在0～0.80之間，UPGMA法聚類分析結(jié)果顯示不同山楂種質(zhì)資源之間距離系數(shù)在 0～0.65之間。 6.分別繪制了基于RAPD標(biāo)記和基于ISSR標(biāo)記的山楂屬植物分子系統(tǒng)進化樹?；赗APD標(biāo)記的山楂屬植物聚類結(jié)果與基于ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果基本一致。但是與ISSR標(biāo)記分析結(jié)果相比，基于RAPD標(biāo)記的分類結(jié)果更接近于根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進行的山楂傳統(tǒng)植物

9、學(xué)分類結(jié)果，RAPD標(biāo)記更適合于山楂屬植物的種內(nèi)、種間的遺傳變異分析。 7.RAPD和ISSR標(biāo)記的分析結(jié)果均表明：在植物學(xué)分類上的伏山楂(Cbrettschneideri Sclllleid.)屬于山楂(C. pinnatifida Bge.)的一個變種或亞種，而不是一個獨立的新種；從遼寧省蓋州市熊岳鎮(zhèn)引入的表現(xiàn)為黑皮綠肉的‘綠肉山楂’資源屬于綠肉山楂(C. chlorosarca Maxim.)；而‘彰武山里紅’是一個新種。

10、 8.全面地進行了山楂胚、胚軸和子葉離體再生的研究，結(jié)果表明：①山楂未成熟子葉、成熟子葉和子葉葉片的再生不定芽能力明顯不同，其中子葉葉片具有較高的再生能力，其不定芽再生頻率是成熟子葉的6倍以上，在附加BA和TDZ各1.0 mg/L的MS培養(yǎng)基上，秋金星子葉葉片的不定芽再生頻率達到33.3％；②山楂的胚軸分化出不定芽，而胚根只形成了愈傷組織，未能分化不定芽；③花后40 d的山楂幼胚離體培養(yǎng)的成苗率很低，供試的15份資源的幼胚的成苗