基于內(nèi)皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立和瓜蔞薤白白酒湯的應(yīng)用.pdf

1、目的:基于心肌纖維化過程的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)，以冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為基礎(chǔ)細(xì)胞，建立一種新的心肌纖維化細(xì)胞模型;并在此模型基礎(chǔ)上，開展該模型的應(yīng)用研究，觀察瓜蔞薤白白酒湯(GXD)對心肌纖維化的影響，明確瓜蔞薤白白酒湯對心肌纖維化的作用機(jī)理及作用靶點(diǎn)，為瓜蔞薤白白酒湯臨床用于心肌纖維化的治療提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)部分。
　　1.基于EndMT心肌纖維化細(xì)胞模型的構(gòu)建:以人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)為

2、基礎(chǔ)細(xì)胞，rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3為候選誘導(dǎo)劑，以內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白CD31和間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白FSP1/α-SMA為檢測指標(biāo)，從作用時(shí)間、劑量、作用強(qiáng)度篩選出合適的誘導(dǎo)劑，并通過檢測心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量、MMP-1、MMP-9進(jìn)行模型的鑒定。
　　2.心肌纖維化細(xì)胞模型的應(yīng)用—瓜萎薤白白酒湯對心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響:由于現(xiàn)在臨床上沒有良好的治療心肌纖維化的藥物，所以本課題選擇具有一定研

3、究基礎(chǔ)的治療“胸痹”的傳統(tǒng)中藥復(fù)方——瓜蔞薤白白酒湯為新構(gòu)建的心肌纖維化細(xì)胞模型的應(yīng)用藥物。利用新構(gòu)建的心肌纖維化細(xì)胞模型，以冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為基礎(chǔ)細(xì)胞，加入誘導(dǎo)劑，復(fù)制心肌纖維化細(xì)胞模型，檢測CD31、FSP1和α-SMA，從細(xì)胞水平觀察瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位對心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響;復(fù)制細(xì)胞模型，檢測TGFβ通路Smad1、Smad2及其上游Notch通路Notch受體North1和Notch配體Jagged1、Jagge

4、d2、DLL1、DLL2、DLL3，從分子水平觀察瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位對心肌纖維化內(nèi)皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.瓜萎薤白白酒湯抑制心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的整體驗(yàn)證:在整體實(shí)驗(yàn)上瓜蔞薤白白酒湯是否也能抑制心肌纖維化的EndMT呢，如果體外——體內(nèi)結(jié)果實(shí)現(xiàn)了一致性，說明應(yīng)用我們構(gòu)建的細(xì)胞模型得到的研究結(jié)果是可靠、可信的。采用結(jié)扎動(dòng)物左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制大鼠心肌纖維化模型，觀察瓜蔞薤白白酒湯對模型動(dòng)物心臟指數(shù)、血流動(dòng)力學(xué)、超聲

5、心動(dòng)圖參數(shù)、心肌酶譜、Ⅰ、Ⅲ型膠原含量、心肌組織病理學(xué)檢查、Masson染色檢查心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)的影響;通過新構(gòu)建的心肌纖維化細(xì)胞模型，我們發(fā)現(xiàn)瓜蔞薤白白酒湯通過Notch通路抑制TGF-β通路而實(shí)現(xiàn)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷EndMT，抑制心肌纖維化。通過組織免疫組化、免疫熒光和Westernblot檢測整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌纖維化組織TGF-β1、CD31、FSP1和α-SMA，以觀察瓜蔞薤白白酒湯對心肌纖維化整體動(dòng)物內(nèi)皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)

6、化的影響，判斷體外——體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有一致性。
　　結(jié)果:
　　1.基于EndMT心肌纖維化細(xì)胞模型的構(gòu)建:在研究劑量范圍100ng/mL～0.01 ng/mL考察rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3對人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響發(fā)現(xiàn)，rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3對HCAEC有著相同的作用，在加入細(xì)胞后48h(2d)，對細(xì)胞活力產(chǎn)生一定的抑制作用(P＜0.05～0.01)，在研究劑量范圍內(nèi)，對

7、HCAEC的抑制作用沒有劑量梯度性，只是有與無的差別。細(xì)胞免疫熒光測定發(fā)現(xiàn):HCAEC經(jīng)rhTGFβ1誘導(dǎo)7d，CD31、FSP1陽性表達(dá)率分別為43.38％、56.60％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ2誘導(dǎo)7d，CD31、FSP1陽性表達(dá)率分別為42.62％、56.20％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ3誘導(dǎo)7d，CD31、FSP1陽性表達(dá)率分別為46.00％、55.32％，rhTGFβ各組間比較沒有顯著性差異;流式檢測發(fā)現(xiàn):HCAEC經(jīng)rhT

8、GFβ1誘導(dǎo)7d，CD31、α-SMA陽性表達(dá)率分別為38.43％、49.13％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ2誘導(dǎo)7d，CD31、α-SMA陽性表達(dá)率分別為37.37％、48.07％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ3誘導(dǎo)7d，CD31、α-SMA陽性表達(dá)率分別為37.9％、50.50％，rhTGFβ各組間比較沒有顯著性差異;collagenⅠ檢測發(fā)現(xiàn):經(jīng)rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ310ng/mL誘導(dǎo)7d后，培養(yǎng)液上清中coll

9、agenⅠ濃度分別達(dá)到了1.29、1.35、1.32μg/mL，rhTGFβ各組間比較沒有顯著性差異?？梢姡隗w外，rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3有著相同的作用，均能誘導(dǎo)HCAEC發(fā)生表型的改變，從動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且誘導(dǎo)效果相近，但在組織環(huán)境中TGFβ1的含量明顯高于TGFβ2、TGFβ3，且TGFβ1介導(dǎo)了胚胎時(shí)期心臟發(fā)育過程中的EndMT，所以本課題決定選取rhTGFβ1為心肌纖維化細(xì)胞模型構(gòu)建中的誘導(dǎo)劑

10、。在確定了誘導(dǎo)劑后，流式細(xì)胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志CD31的表達(dá)逐漸減少，間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志α-SMA的表達(dá)逐漸增加，但誘導(dǎo)效率并不隨著劑量的增加而增加，劑量100ng/mL與10ng/mL有著相同的誘導(dǎo)效率，1 ng/mL和0.1 ng/mL的誘導(dǎo)效率低于10ng/mL，即誘導(dǎo)效率100 ng/mL=10ng/mL＞1ng/mL＞0.1 ng/mL，所以誘導(dǎo)劑的最佳劑量為終濃度10ng/mL;以10ng/mL的rh

11、TGFβ1在不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)的α-SMA+間質(zhì)細(xì)胞擬合曲線，計(jì)算出經(jīng)rhTGFβ110ng/mL誘導(dǎo)7天為最佳作用時(shí)間。HCAEC經(jīng)rhTGFβ1誘導(dǎo)7d，心肌纖維化各項(xiàng)指標(biāo)collagenⅠ、MMP-1/MMP-9表達(dá)明顯增加。利用內(nèi)皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化構(gòu)建心肌纖維化細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑為rhTGFβ1，作用劑量為10ng/mL，作用時(shí)間為7天，可成功構(gòu)建該細(xì)胞模型。
　　2.心肌纖維化細(xì)胞模型的應(yīng)用—瓜萎薤白白酒湯對心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)

12、轉(zhuǎn)化的影響:流式法和Westernblot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志CD31和間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志FSP/α-SMA發(fā)現(xiàn):HCAEC經(jīng)rhTGFβ1誘導(dǎo)7天，可成功復(fù)制心肌纖維化模型，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的減少，使細(xì)胞保持內(nèi)皮特性，并抑制其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與模型組比較，P＜0.05～0.01，從而達(dá)到對EndMT的調(diào)控作用;通過新構(gòu)建的心肌纖維化細(xì)胞模型，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位可明顯下調(diào)TGF-β通路的Smad1、S

13、mad2和Notch通路的North1、Jagged1、、Jagged2、DLL1、DLL2表達(dá)(P＜0.05～0.01)，而達(dá)到抑制EndMT。說明瓜萎薤白白酒湯通過Notch通路抑制TGF-β通路而實(shí)現(xiàn)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷EndMT，抑制心肌纖纖維化。
　　3.瓜萎薤白白酒湯抑制心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的整體驗(yàn)證:利用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制心肌纖維化動(dòng)物模型，給予瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位三個(gè)劑量(6、12、24g生藥/kg

14、)，連續(xù)4周。超聲心動(dòng)圖顯示，與模型組比較，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇組部位可明顯降低LVID、LVEDV、LVESV和升高IVS、LVPW、EF、FS(P＜0.05～0.01);還可改善模型大鼠的血流動(dòng)力學(xué)水平，高劑量組可顯著增加LVSP、±dp/dtmax、HR、SAP和DAP，同時(shí)中、高劑量可減少LVEDP，與模型組比較P＜0.05～0.01;顯著抑制心肌酶譜AST、LDH和CK-MB的增加，與模型組比較P＜0.05;與模型組相比，瓜蔞

15、薤白白酒湯高劑量組可見LVM、HM、LVMI、HMI的顯著降低(P＜0.05～0.01);心臟組織病理學(xué)檢查顯示，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇組肌纖維排列較有序、整齊，心肌細(xì)胞輕度肥大，間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維組織輕度增生，染色相對均勻，Masson染色法顯示瓜蔞薤白白酒湯正丁醇中、高劑量組心肌細(xì)胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則有序，心肌組織藍(lán)色膠原染色部分較模型組有所減少;瓜蔞薤白白酒湯正丁醇中、高劑量組的CVF值和羥脯氨酸含量較模型組明顯降

16、低;瓜蔞薤白白酒湯正丁醇組大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量較模型組心肌組織中的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05～0.01)?？梢?，瓜蔞薤白白酒正丁醇部位對心肌纖維化大鼠有明顯的保護(hù)作用，這為以后開展將瓜蔞薤白白酒湯應(yīng)用于本課題新構(gòu)建的心肌纖維化細(xì)胞模型的應(yīng)用確立了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。整體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瓜蔞薤白白酒湯可顯著降低TGF-β1的表達(dá)，抑制心肌纖維化所致CD31表達(dá)的減少和α-SMA/FSP1表達(dá)的增加(P＜0.05～0.01)，這一

17、結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)是一致的，瓜蔞薤白白酒湯通過抑制EndMT實(shí)現(xiàn)抗心肌纖維化作用。說明通過新構(gòu)建的心肌纖維化細(xì)胞模型所得的研究數(shù)據(jù)是真實(shí)、可靠、可信的。
　　結(jié)論:構(gòu)建基于內(nèi)皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的心肌纖維化細(xì)胞模型的方法為:以人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為基礎(chǔ)細(xì)胞，rhTGFβ1為誘導(dǎo)劑，在終濃度為10ng/mL的誘導(dǎo)劑作用7天時(shí)，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志，并高表達(dá)心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)。將該方法成功應(yīng)用于瓜蔞薤白白酒湯對心