赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè) 方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus,NNV)是多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類的病原，容易感染稚魚(yú)和幼魚(yú)。其導(dǎo)致的病毒性神經(jīng)壞死病死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)該病的治療還沒(méi)有有效的藥物和疫苗，因此開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測(cè) NNV的方法非常重要。
　　本文針對(duì)赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒，設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了交叉引物等溫?cái)U(kuò)增體系，并對(duì)該方法的Mg2+濃度、dNTPs濃度、反應(yīng)溫度三個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)

2、化。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：5mmol/L MgCl2、1.2mol/L Betaine、1.2mmol/L dNTPs、1.6μmol/L引物1a、0.8μmol/L引物2a/3a、0.2μmol/L引物4s/5a、10× ThermoPol Buffer2.5μL、Warmstart Bst DNA聚合酶8 U、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶28 U以及適量的RNA模板，DEPC水補(bǔ)足至25μL。優(yōu)化后的反應(yīng)參數(shù)為69℃保溫60 min，然后80℃

3、保溫5 min終止反應(yīng)，最后采用切向流試紙條通過(guò)肉眼判斷檢測(cè)結(jié)果。該方法的檢測(cè)極限為101copies/μL RNA模板,比常規(guī)RT-PCR高10倍，與熒光定量RT-PCR靈敏度相當(dāng)。該方法反應(yīng)特異性良好，與病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）、傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）、大菱鲆紅體病虹彩病毒（TRBIV）、淋巴囊腫病毒（LCDV）、哈維氏弧菌(Vibrio. harveyi)、鰻弧菌(V. anguillarum)等多種魚(yú)類病原均無(wú)

4、交叉反應(yīng)。使用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，與LAMP試劑盒方法相比較，更容易分辨陰性和弱陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)所建立的赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒交叉引物等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合切向流試紙條方法（CPA-LFD）簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高且特異性強(qiáng),可以廣泛用于疾病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。
　　近年來(lái)，表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）用于基因的檢測(cè)越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。本研究還為快速檢測(cè)魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒，設(shè)計(jì)了病毒特異性的發(fā)夾型探針，經(jīng)硫醇修飾后與納米銀溶膠結(jié)合，制備了魚(yú)類

5、神經(jīng)壞死病毒納米探針（Ag-NNV），并使用透射電鏡、多功能酶標(biāo)儀、表面增強(qiáng)拉曼光譜儀等對(duì)納米探針Ag-NNV的表征及發(fā)夾型探針在納米銀粒子表面的覆蓋率進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果表明，裸露的納米銀粒子為球形，平均直徑50nm；制備的納米探針顆粒為球形，平均直徑90nm。納米銀粒子和納米探針在溶液中均具有良好的分散性。平均每個(gè)納米銀粒子表面結(jié)合發(fā)夾型探針約100條，單位表面積的探針覆蓋量為0.56pmol/cm2。該納米探針制備簡(jiǎn)便，適合用于