半滑舌鰨神經(jīng)壞死病毒病的研究.pdf

1、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）作為一種新興的海水養(yǎng)殖品種，在我國北方沿海地區(qū)快速發(fā)展，并實(shí)現(xiàn)了工廠化和產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。由于發(fā)展過快，魚類疾病防控研究不足，我國養(yǎng)殖半滑舌鰨疾病流行日益嚴(yán)重，造成了大量魚苗死亡以及經(jīng)濟(jì)損失。2012年8月，我國北方某育苗場暴發(fā)半滑舌鰨魚苗大規(guī)模死亡。依據(jù)發(fā)病魚苗的外觀癥狀及分子生物學(xué)檢測，初步確定其為由魚類病毒性神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus, NNV）引起

2、的半滑舌鰨病毒性神經(jīng)壞死病。通過對(duì)該病的現(xiàn)場調(diào)查、人工感染實(shí)驗(yàn)、組織病理觀察、病原分子生物學(xué)分類鑒定等研究，證實(shí)該病的病原是赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒（redspotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV），同時(shí)證實(shí)半滑舌鰨為該病毒新的自然感染宿主。
　　疾病現(xiàn)場調(diào)查顯示，該病主要引起13～30日齡的半滑舌鰨魚苗發(fā)病，累積死亡率可達(dá)90％~100%。50日齡左右的半滑舌鰨魚苗也可被病毒感染，

3、但不發(fā)病。疾病的高發(fā)季節(jié)為7~8月，水溫22～24 oC?；疾◆~苗體表無出血、潰爛等現(xiàn)象；部分魚苗呈現(xiàn)螺旋型游動(dòng)，或全身大幅度波浪狀浮動(dòng)，間或有短暫的狂游現(xiàn)象，嚴(yán)重者出現(xiàn)脊柱畸形彎曲。
　　人工感染實(shí)驗(yàn)表明，25日齡半滑舌鰨魚苗對(duì)該病高度敏感，病魚具有典型的魚類神經(jīng)壞死病癥狀。25日齡魚苗人工感染后第2天開始死亡，感染4天內(nèi)死亡率達(dá)100%。但50日齡半滑舌鰨魚苗對(duì)該病不敏感，累積死亡率低于20%，與對(duì)照組相比無顯著差異。通過組織

4、病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，自然感染的20日齡和人工感染的25日齡患病魚苗的腦組織和視網(wǎng)膜組織壞死、空泡化，感染的細(xì)胞表現(xiàn)為嗜堿性增強(qiáng)，呈典型的病毒性神經(jīng)壞死病理現(xiàn)象，并且PCR檢測結(jié)果也呈現(xiàn)強(qiáng)陽性。人工感染的50日齡半滑舌鰨魚苗，組織病理切片顯示腦部與視網(wǎng)膜組織無空泡化現(xiàn)象，但是PCR檢測結(jié)果呈現(xiàn)弱陽性，證明50日齡的魚苗攜帶病毒但是不發(fā)病，與50日齡半滑舌鰨魚苗的低死亡率現(xiàn)象相一致。
　　為確定半滑舌鰨神經(jīng)壞死病毒的分類地位，以及與其它魚

5、類神經(jīng)壞死病毒的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究運(yùn)用5’ RACE和環(huán)化RACE技術(shù)測定了半滑舌鰨神經(jīng)壞死病毒的基因組全序列，并進(jìn)行了序列比對(duì)分析。測序結(jié)果表明：該病毒的基因組由兩條正義單鏈RNA組成（RNA1和RNA2），其中RNA1全長3104 nt，RNA2全長1433 nt。RNA1編碼982個(gè)氨基酸殘基的病毒RNA聚合酶（RNA-dependantRNA polymerase，RdRp），RNA2編碼338個(gè)氨基酸殘基的病毒主要衣殼蛋白（

6、major capsid protein，MCP）。RNA3位于RNA1鏈的2753-2980 nt，編碼76個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。上述基因組全序列已提交到GenBank中，檢索號(hào)分別為KJ541747和KJ541748。全序列比對(duì)結(jié)果顯示，對(duì)于RNA1序列，半滑舌鰨神經(jīng)壞死病毒與已報(bào)道的RGNNV的相似度為96%~99%，與SJNNV、BFNNV和TPNNV的相似度均為82%左右；對(duì)于RNA2序列，半滑舌鰨神經(jīng)壞死病毒與已報(bào)道的RG

7、NNV的相似度為96%~98%，與SJNNV、BFNNV、TPNNV和TNV的相似度為77%~86%。因此，可以確定本研究發(fā)現(xiàn)的感染半滑舌鰨的神經(jīng)壞死病毒為RGNNV基因型，命名為RGNNV CsCN128分離株。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果也表明，RGNNV CsCN128與分離自日本及中國的RGNNV聚類在一起，與SJNNV、BFNNV和TPNNV等其它魚類神經(jīng)壞死病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　由于缺乏有效的疫苗，臭氧處理是目前最常用且最有效的

8、控制神經(jīng)壞死病毒病的方法。但如何評(píng)價(jià)臭氧對(duì)病毒的消毒效果這一問題尚未解決。本研究依據(jù)臭氧處理可以使魚類神經(jīng)壞死病毒的RNA鏈斷裂、失去完整性的原理，利用RGNNV RNA2序列，在其3’端設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物，在5’端設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建了一種可以評(píng)價(jià)RNA2鏈相對(duì)完整性的RT-PCR方法，命名為LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR)，并對(duì)該方法的引物濃度、退火溫度、

9、Mg2+濃度、dNTPs濃度等四個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。本研究建立的LR RT-PCR方法靈敏度高，可以檢出1 pg的RGNNV RNA；該方法特異性強(qiáng)，與鰻弧菌、哈維氏弧菌等常見水產(chǎn)病原菌、RSIV等魚類病毒以及石斑魚RNA均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。應(yīng)用本研究建立的LR RT-PCR方法對(duì)臭氧破壞RGNNV RNA2的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)臭氧濃度由0.3 mg/L依次增加為0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L時(shí)，LR RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)