鱖傳染性脾腎壞死病毒病基因工程疫苗的構(gòu)建研究.pdf

1、近年來，頻頻暴發(fā)的鱖流行性疾病對(duì)廣東省的鱖養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害。對(duì)該流行性疾病的研究表明，其主要病原是傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)。組織漿疫苗對(duì)預(yù)防鱖ISKNV病有一定的效果，但是材料來源有季節(jié)性和數(shù)量上的限制，且成本較高，不利于推廣，目前還無法獲得細(xì)胞滅活疫苗和弱毒疫苗，進(jìn)行基因工程疫苗的研究則可為鱖ISKNV病的預(yù)防提供新的思路。研究表明，主

2、要衣殼蛋白（major capside protein, Mcp）是病毒粒子的主要抗原蛋白。本實(shí)驗(yàn)克隆了ISKNV Mcp基因；進(jìn)行了Mcp基因的原核表達(dá)；制備了抗重組Mcp的抗血清；構(gòu)建了重組Mcp基因的DNA疫苗(pcDNAMcp)并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)研究。具體研究?jī)?nèi)容包括： 1 ISKNV Mcp基因的克隆與序列分析 根據(jù)鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)主要衣殼蛋白（Mcp）基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到一長(zhǎng)約14

3、00bp的DNA片段， 將其克隆到pGEM-T Easy Vector。對(duì)重組子進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明所克隆的片段為ISKNV Mcp基因，它含有一個(gè)1362bp的開放讀碼框（ORF），編碼454個(gè)氨基酸，推算的Mcp分子量為49.665kDa，等電點(diǎn)（pI）為6.01。氨基酸親水性分析表明，在150-250位氨基酸之間親水性很高，可能構(gòu)成主要抗原決定簇。 2 ISKNV Mcp基因的原核表達(dá)及重組 Mcp 的免疫原性分析

4、 Mcp基因經(jīng)PCR改造后克隆至原核表達(dá)載體pBV220，構(gòu)建表達(dá)Mcp的大腸桿菌基因工程菌，該工程菌經(jīng)42℃誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)，在約50kDa處有一特異蛋白帶，含量約為菌體總蛋白的23％。用純化和復(fù)性后的重組Mcp免疫新西蘭大白兔制備抗血清，Western blotting分析顯示，重組Mcp制備的抗血清能與ISKNV Mcp特異結(jié)合，說明表達(dá)產(chǎn)物具有與ISKNV Mcp相似的抗原特性。 3 含ISKNV Mc

5、p 基因的DNA疫苗的構(gòu)建及其表達(dá)研究 利用PCR方法對(duì)Mcp基因進(jìn)行改造，改造后的Mcp基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1+，構(gòu)建DNA疫苗(pcDNA-Mcp)。將該DNA疫苗肌肉注射鯽魚，3天后提取注射部位肌肉的RNA, 用RT(Reverse Transcript)－PCR方法可證明Mcp基因在魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄；將DNA疫苗轉(zhuǎn)染草魚腎細(xì)胞系（CIK）和鯉魚上皮瘤細(xì)胞系（EPC），經(jīng)Western blotting檢測(cè)，M