傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)VP092R的鑒定及功能研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)屬于虹彩病毒科(iridoviridae)腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus)，是造成養(yǎng)殖鱖暴發(fā)性死亡的主要病原，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室率先于2001年成功完成了ISKNV全基因組序列測(cè)定、ORF劃分和序列分析工作，為ISKNV基因進(jìn)行更深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 基于對(duì)ISKNV全基因組測(cè)序結(jié)果及生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果分析，本論文選定線粒體相關(guān)病毒基因ORF09

2、2R進(jìn)行功能研究。通過RACE技術(shù)成功獲得了該基因全長(zhǎng)cDNA，確定其轉(zhuǎn)錄本位于ISKNV基因組的84394～85757bp處(全長(zhǎng)1364bp)。使用ORF092R特異性RNA探針進(jìn)行Northern blot分析，雜交得到一條與RACE結(jié)果大小一致的轉(zhuǎn)錄本。對(duì)ISKNV感染后ORF092R的轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析表明，ORF092R作為一個(gè)早期基因在病毒感染的早期階段轉(zhuǎn)錄。使用自制的VP092R蛋白C端肽段抗體進(jìn)行Western blot及細(xì)

3、胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了VP092R蛋白在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。RACE、Northern blot以及Western blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該基因在ISKNV感染的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。
　　 借助激光共聚焦顯微鏡觀察及亞細(xì)胞組分分離方法，對(duì)該基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VP092R蛋白為線粒體內(nèi)膜定位蛋白，其定位方向可能為N端朝向線粒體基質(zhì)而C端朝向線粒體膜間隙。通過對(duì)其定位信號(hào)的研究我們發(fā)現(xiàn)，該蛋白不具有典型的

4、線粒體N端導(dǎo)肽序列，而跨膜區(qū)可能作為該蛋白內(nèi)部的定位信號(hào)序列對(duì)于線粒體定位具有重要作用。VP092R蛋白線粒體定位的研究結(jié)果為深入挖掘與之相互作用的蛋白及可能參與的功能提供了一定的研究思路和線索提示。
　　 通過GST Pull-down實(shí)驗(yàn)，從斑馬魚線粒體鑒定出一個(gè)可與VP092R在體外特異性結(jié)合的蛋白，即線粒體熱休克蛋白70(mtHSP70)。mtHSP70，也叫Mortalin/PBP74/GRP75，是熱休克蛋白70家族

5、成員，其功能涉及腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡、抗原處理以及調(diào)節(jié)血糖反應(yīng)等多個(gè)方面。隨后的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VP092R與BHK細(xì)胞內(nèi)源性mtHSP70在體內(nèi)相互作用，推測(cè)二者的相互作用可能影響下游腫瘤抑制蛋白p53的轉(zhuǎn)錄活性和功能。VP092R相互作用蛋白研究為揭示該病毒蛋白對(duì)宿主細(xì)胞相關(guān)機(jī)能的影響，探索病毒感染與宿主相互作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 為研究該基因?qū)?xì)胞生理機(jī)能的影響，本論文篩選出穩(wěn)定表達(dá)VP092R蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，進(jìn)行