傳染性造血器官壞死病病毒的分離鑒定及其糖蛋白抗血清的制備和應(yīng)用.pdf

1、本研究從吉林省某漁場患病的虹鱒幼魚中分離得到了一株病毒，毒株編號IHNV-1008，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以及電鏡觀察的結(jié)果，確定該病毒分離株為傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)，并對其理化特性、生物特性進(jìn)行了研究。同時，建立IHNV原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出IHNV糖蛋白作為免疫原，免疫小鼠制備抗血清，并對其進(jìn)行效價測定及與全病毒免疫反應(yīng)等應(yīng)

2、用。結(jié)果如下:
　　 本次所分離的病毒株，通過RT-PCR可擴(kuò)增出特異性條帶，進(jìn)一步對感染該病毒的細(xì)胞切片進(jìn)行電鏡觀察，在細(xì)胞質(zhì)中可見到大量病毒顆粒，呈典型彈狀，直徑約為(70～90) nm，長度(150～170) nm。挑斑純化后，對其特性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示該病毒能夠使EPC、FHM等5種常見水生細(xì)胞產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(Cytopathiceffects，CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，聚集成葡萄狀，形成空斑，最終完全脫離。病毒生長曲

3、線顯示產(chǎn)生CPE5 d后，病毒達(dá)到最大感染滴度，約為106.6TCID50/100μL。理化特性試驗(yàn)結(jié)果顯示該病毒增殖溫度為10℃～25℃，最適溫度為15℃，不耐熱，對脂溶劑和酸敏感，對堿具有較強(qiáng)抗受能力。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示，該病毒蛋白條帶與IHNV文獻(xiàn)記載的相近似。
　　 以IHNV感染的細(xì)胞懸液為材料，應(yīng)用RT-PCR方法克隆病毒的糖蛋白基因，并將其亞克隆至原核表達(dá)載體pCWori，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH

4、5α，通過發(fā)酵大腸桿菌制備病毒糖蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式存在，使用Ni-NTA親和層析柱在變性條件下進(jìn)行純化并透析復(fù)性，最終得到了較高純度的可溶性糖蛋白，分子量約為57 KDa。免疫印跡(Western-blot)分析結(jié)果顯示所表達(dá)的蛋白能夠被兔抗IHNV血清識別。用復(fù)性后的蛋白免疫小鼠制備抗血清，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)顯示抗體效價可達(dá)1∶64000。經(jīng)制備的抗血清可以作為一抗建立ELI