對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)病毒樣顆粒的研究.pdf

1、對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)是世界各地養(yǎng)殖和野生對(duì)蝦的重要病原之一，隸屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)短濃核癥病毒屬(Brevidensovirus)。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)IHHNV的核衣殼蛋白(capsid protein，CP)在大腸桿菌中能夠重組表達(dá)并自組裝成與天然病毒粒子大小、形態(tài)相類(lèi)似的病毒樣顆粒(

2、virus-like particles，VLPs)。由于缺乏病毒基因組，該VLPs不能自行復(fù)制增殖，但間接免疫熒光染色方法證明IHHNV-VLPs能夠與凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞發(fā)生一定的相互作用，可以吸附并進(jìn)入血細(xì)胞。這種特殊的性質(zhì)決定了IHHNV-VLPs也許可以作為一種攜帶外源物質(zhì)的載體被廣泛應(yīng)用。本文主要圍繞IHHNV-VLPs的衣殼結(jié)構(gòu)、組裝機(jī)理及包裹核酸的性質(zhì)進(jìn)行研究，包括以下幾個(gè)方面： (1)為了研究IHHNV的衣殼結(jié)構(gòu)

3、，將純化的IHHNV-VLPs超速離心，取上清分別進(jìn)行電鏡觀察，blue-native PAGE分析及凝膠過(guò)濾層析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明了超離上清中存在單體和五聚體兩種狀態(tài)，即IHHNV的衣殼結(jié)構(gòu)只有五聚體殼粒構(gòu)成。為了進(jìn)一步研究形成這種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用力，我們分別用EDTA和DTT處理VLPs。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，VLPs經(jīng)EDTA處理后結(jié)構(gòu)無(wú)變化，而DTT處理后其結(jié)構(gòu)發(fā)生解離。進(jìn)一步用非還原型SDS-PAGE證明CP蛋白在組裝成VLPs時(shí)無(wú)分子

4、間二硫鍵作用，而只有分子內(nèi)二硫鍵，說(shuō)明分子內(nèi)二硫鍵對(duì)于維持IHHNV核衣殼結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是必須的。 (2)熒光病毒樣顆粒(fluorescent virus-like particles，fVLPs)在研究病毒的結(jié)構(gòu)和感染方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。我們將EGFP引入CP蛋白的C端，與CP共表達(dá)后即組裝成帶有EGFP的VLPs，即IHHNV-fVLPs。SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)fVLPs內(nèi)包含的CP-EGFP只有CP的1/14，進(jìn)一步用免疫

5、金標(biāo)實(shí)驗(yàn)證明EGFP很可能被展示于fVLPs的表面。與對(duì)蝦血細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，IHHV-fVLPs可以結(jié)合并進(jìn)入對(duì)蝦原代細(xì)胞。 (3)IHHNV的衣殼蛋白基因可在大腸桿菌中重組表達(dá)，并自組裝成病毒樣顆粒。從純化的病毒樣顆粒中提取核酸，發(fā)現(xiàn)大小在400bp-900bp之間。分別用DNase和RNase消化后瓊脂糖分析發(fā)現(xiàn)，IHHNV-VLPs包裹的核酸中多為RNA。Northern雜交實(shí)驗(yàn)證明，其RNA的包裹是非特異性的。

6、 (4)為了使VLPs特異性地包裹某些外源物質(zhì)，如siRNA或dsRNA，我們利用指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)對(duì)IHHNV全基因組進(jìn)行篩選，以期找到與CP蛋白結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。將IHHNV全基因組超聲隨機(jī)打斷至200bp左右片段，補(bǔ)平后加接頭，與已結(jié)合在Ni柱上的CP蛋白在復(fù)性液中孵育結(jié)合，篩選到的DNA經(jīng)