傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)ORF125的功能研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)屬于虹彩病毒科(iddoviridae)腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus),是導(dǎo)致鱖(Siniperca chuatsi)暴發(fā)性死亡的重要病原,給我國鱖養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。本實驗室于2001年成功完成了ISKNV全基因組序列測定、ORF劃分和序列分析工作,為ISKNV基因進行更深入研究奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)

2、生物信息學(xué)分析,在ISKNV基因組中存在多個錨蛋白重復(fù)序列家族基因(ankyrin repeat gene familyprotein),這些基因在ISKNV感染中的作用尚未清楚.本論文選取了其中一個錨蛋白重復(fù)序列家族基因ORF125進行功能研究。
　　 本文首先通過RACE技術(shù)成功獲得了ISKNV ORF125基因的cDNA序列,并對ORF125的翻譯起始點位置進行了更正。更正后的ORF125大小為825bp,編碼大小為29.

3、4kDa的蛋白。同時制備了ORF125蛋白的抗體,并以此抗體進行Western blot,證實了ORF125蛋白在病毒感染的細胞中表達。ISKNV感染后ORF125的轉(zhuǎn)錄時相分析表明,ORF125為晚期基因。
　　 通過pull-down實驗,我們從斑馬魚(Danio rerio)總蛋白中鑒定出一個可與ORF125蛋白在體外結(jié)合的蛋白IKKβ。通過簡并引物和RACE的方法,克隆了鱖IKKβ,并對此基因進行了序列的分析和特性的鑒定

4、。隨后,我們采用免疫共沉淀的方法證實ORF125蛋白與IKKβ的相互作用。由于IKKβ是NF-κB信號通路的重要分子,我們借助人類細胞系統(tǒng)深入研究了ISKNV ORF125與NF-κB的關(guān)系。首先通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗,發(fā)現(xiàn)ORF125蛋白可抑制TNFα和PMA對NF-κB的激活,但對AP-1信號影響不大。Western blot檢測也顯示ORF125蛋白可抑制IκBα的磷酸化和NF-κB的核轉(zhuǎn)位。綜合這些結(jié)果表明ISKNVORF

5、125蛋白抑制NF-κB信號通路的靶點在IKK復(fù)合物處。另外,我們采用免疫共沉淀的方法,從293T細胞總蛋白中找到ORF125的另一相互作用的蛋白GSTP1,推測ORF125可能是一個多功能基因。
　　 為探尋ISKNV ORF125在實際感染過程中的作用,本文進一步研究了ISKNV與宿主NF-κB的關(guān)系。通過實時定量PCR檢測NF-κB調(diào)控的基因IL8、TNFα、CC型趨化因子和IL-1β在ISKNV感染過程中的表達水平,我們