鱖傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗檢驗關鍵技術研究.pdf

1、由鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)引起的鱖虹彩病毒病是危害鱖養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最主要疫病，而疫苗接種是預防該病最為有效的技術手段。在疫苗制備過程中，安全性和效力是評價疫苗質量重要指標，而滅活快速檢驗及抗原含量測定是評價滅活疫苗安全性和效力的關鍵技術，因此本論文針對ISKNV滅活疫苗制備中關鍵問題，開展了ISKNV滅活快速檢驗及有效抗原含量測定方法研究及應用，旨在提高ISKNV滅活疫苗生產(chǎn)效率和疫苗質量，取得的主要結果如下:
　　1、從IS

2、KNV感染CPB細胞轉錄譜中篩選并驗證病毒早期基因ORF099基因表達量最高，以該基因轉錄本作為靶標，建立了基于熒光定量RT-PCR監(jiān)測病毒mRNA的滅活快速檢測方法。首先，以含ISKNV ORF099基因質粒作為模板，采用qPCR方法繪制了CT值與質粒拷貝數(shù)的標準曲線，其線性方程為CT=-3.421gx+39.455(R2=0.998)，最低檢測限為3拷貝/μL，重復試驗結果顯示組間和組內(nèi)變異系數(shù)均小于2％。病毒轉錄本靈敏度實驗顯示在

3、第7d即可從接種1個拷貝病毒的細胞中檢測出ISKNV ORF099轉錄本。采用該方法對0.1％甲醛滅活72 h后的ISKNV樣品接種CPB細胞可檢測到ISKNV ORF099基因轉錄本，而0.1％終濃度甲醛滅活ISKNV在CPB細胞盲傳三代未出現(xiàn)CPE，魚體安全試驗顯示接種魚體后無臨床發(fā)病癥狀和試驗魚死亡，表明該方法靈敏度高于細胞盲傳法和魚體安全試驗法。
　　2、通過將ISKNV感染CPB細胞后所獲得的病毒Unigene與病毒基因

4、組比對篩選獲得可能存在內(nèi)含子的病毒基因，經(jīng)RT-PCR驗證確認ORF003L含有80bp內(nèi)含子，該內(nèi)含子命名為IN-3。跨IN-3內(nèi)含子設計巢氏PCR引物擴增ISKNV感染CPB細胞后cDNA，建立了基于跨內(nèi)含子設計引物檢測病毒mRNA的滅活快速巢氏PCR檢測方法。結果顯示在第7d可從接種1個拷貝病毒的細胞cDNA樣品中檢測出209bp和289 bp兩條帶，說明該方法可排除樣品中病毒DNA殘留影響。采用該方法對0.1％甲醛滅活樣品接種C

5、PB細胞可檢測到ORF003L基因轉錄本，而細胞盲傳實驗中未出現(xiàn)CPE，魚體安全試驗中無臨床發(fā)病癥狀和試驗魚死亡，表明該方法靈敏度高于細胞盲傳法和魚體安全試驗法。
　　3、用蔗糖密度梯度離心純化ISKNV病毒粒子，采用常規(guī)雜交瘤技術制備特異性單克隆抗體。利用ISKNV重組MCP蛋白篩選獲得2株特異性的單克隆抗體株，分別命名為1C81B9和3B126B3，制備這2株單抗腹水，其效價為1∶106～1∶103，收集后的腹水選用Prote

6、in G-瓊脂糖親和層析柱進行純化。以單克隆抗體株1C81B9作為包被單抗，生物素標記的單克隆抗體株3B126B3作為檢測抗體，建立了ISKNV有效抗原含量測定的雙抗體夾心ELISA檢測方法。該方法檢測線性范圍為:4.69～300ng/mL，最低檢測限為0.9 ng/mL的抗原。用建立的方法檢測3個批次的ISKNV滅活疫苗有效抗原含量，結果與滅活前病毒滴度呈正相關。
　　4、采用建立的滅活快速檢驗方法和有效抗原含量測定方法優(yōu)化了I

7、SKNV滅活條件，制定了抗原的保存期。采用二乙烯亞胺(BEI)、甲醛和β-丙內(nèi)酯(BPL)3種化學滅活劑在不同條件下對ISKNV進行滅活，結果表明0.2％甲醛和4％ BEI在30℃滅活72h、0.1％ BPL在4℃滅活6h即可徹底滅活ISKNV;有效抗原含量測定結果表明BPL制備的病毒有效抗原含量均高于另外兩種滅活劑，滅活條件為采用0.1％ BPL在4℃滅活6h。將制備的病毒抗原液分別置于4℃和-80℃條件下保存1、3、6、12個月后檢