傳染性胰腺壞死病毒VP2抗原表位區(qū)間接免疫熒光方法的建立.pdf

1、傳染性胰腺壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)是引起傳染性胰腺壞死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)的病原，IPN是一種以內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官出血、壞死為主要病理特征的高度接觸性、急性傳染病。本病對(duì)鮭鱒魚類稚魚易感，可引起14～70 d稚魚大面積死亡，致死率高達(dá)90％。感染后幸存的魚可終生帶毒，成為潛在的感染源。該病流行范圍廣，發(fā)病和致死率高，是我

2、國及世界各國家鮭鱒幼魚死亡的重要疫病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究利用RT-PCR方法從感染IPNV-ZYX分離株細(xì)胞培養(yǎng)液中擴(kuò)增出IPNV病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2的抗原表位區(qū)基因(554～1170 bp)，命名為VP2 COE(616 bp)，該序列與GenBank上發(fā)表的美國毒株AF342728同源性高達(dá)99.8％，只在710位堿基A→T。將獲得的VP2 COE基因定向插入pET30a、pET28a、pProE

3、x HTb、pGEX-6p-1、pCold TF五種不同原核表達(dá)載體中，以期獲得可溶形式表達(dá)的重組蛋白。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coil)，在其中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，分別獲得重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定表明前四種表達(dá)載體表達(dá)的重組蛋白均以包涵體形式表達(dá)，其中以pProEx HTb載體表達(dá)的重組蛋白表達(dá)量最大，占菌體總量的24％。通過Western Blot進(jìn)一步分析表明pProEx HTb-VP2 COE重組蛋白得到了正確表達(dá)，

4、其產(chǎn)物分子量約為30 kDa。故選取pProEx HTb-VP2 COE重組蛋白作為后續(xù)研究的對(duì)象。同時(shí)，經(jīng)SDS-PAGE分析pCold TF-VP2 COE重組蛋白以可溶形式表達(dá)。通過WesternBlot進(jìn)一步分析表明pCold TF-VP2 COE重組蛋白得到了正確表達(dá)，其產(chǎn)物分子量約為78kDa。分別將切膠純化獲得的蛋白利用谷胱甘肽還原系統(tǒng)復(fù)性；變性法親和層析獲得蛋白后，尿素梯度透析復(fù)性，結(jié)果表明采用PBS緩沖液體系，在4℃條

5、件下，pH值為8.0，復(fù)性液中尿素梯度變化為6 M、4 M、2 M、1.5 M、1 M、0.5 M、0 M時(shí)，蛋白的復(fù)性率最高，回收率可以達(dá)到30％。將切膠純化的pProEx HTb-VP2 COE重組蛋白、谷胱甘肽復(fù)性的pProExHTb-VP2 COE重組蛋白、變性親和層析純化的pProEx HTb-VP2 COE重組蛋白、尿素梯度復(fù)性pProEx HTb-VP2 COE重組蛋白、純化的pCold TF-VP2 COE融合蛋白分別稀

6、釋至0.3mg/ml，免疫6～8周齡BALB/c小鼠。產(chǎn)生的抗體經(jīng)間接ELISA分析，均可與IPNV(ATCCVR-1318)特異反應(yīng)，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清、抗pProEx HTb-VP2 COE親和層析變性純化血清、抗pProEx HTb-VP2 COE尿素梯度復(fù)性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE谷胱甘肽復(fù)性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE切膠純化血清ELISA效價(jià)分別為：1:1280

7、0、1：1600、1:6400、1:3200、1:1600。同時(shí)中和試驗(yàn)表明，五種血清均具有中和IPNV(ATCCVR-1318)的能力，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清、抗pProEx HTb-VP2 COE親和層析變性純化血清、抗pProEx HTb-VP2 COE尿素梯度復(fù)性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE谷胱甘肽復(fù)性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE切膠純化血清中和效價(jià)分別為：1:51.29、

8、1:44.67、1:25.70、1:12.88、1:3.02。以上兩項(xiàng)結(jié)果表明，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清具有比較好的抗原性。
　　 本文以制備的抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清為一抗、熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG為二抗，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測(cè)IPNV抗原的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)方法。確立的最佳反直條件為：IPNV(ATCC VR-1318)最佳接種濃度和培養(yǎng)條件是IPNV10-5接種EP

9、C細(xì)胞，18℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h；細(xì)胞固定劑為4％的多聚甲醛；抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清最適工作濃度為1:80倍稀釋；FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG熒光抗體的最適工作濃度為1:200倍稀釋。通過以上條件摸索，確立IPNV間接免疫熒光鑒別診斷方法。用建立的IFA檢測(cè)方法檢測(cè)，與IHNV-ZYX分離株、IBDV無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性，且多次重復(fù)性試驗(yàn)穩(wěn)定性較好；以相同方法檢測(cè)IPNV(ATCC VR-1318)，抗