長江、黃河、遼河水系中華絨螯蟹野生群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析.pdf

1、與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記不同，分子標(biāo)記可以從DNA水平上體現(xiàn)出物種的遺傳多樣性，其中微衛(wèi)星DNA標(biāo)記由于具備諸多優(yōu)點，通常被認(rèn)為是群體遺傳多樣性分析的理想標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記用于中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）群體遺傳學(xué)分析的研究已有一些報道，然而之前報道由于采樣時間較早、水域不同加之中華絨螯蟹（河蟹）野生群體的生存繁衍處在動態(tài)變化中，長江、黃河、遼河三個主產(chǎn)水系的遺傳現(xiàn)狀尚存在不確定性，進(jìn)一步的種質(zhì)評價工作有待進(jìn)行。本研究針對中

2、華絨螯蟹種群遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析這一目標(biāo)，為更好的開展微衛(wèi)星分子標(biāo)記在河蟹種群遺傳分析上的應(yīng)用，首先從優(yōu)化DNA提取方法入手，然后比較優(yōu)選微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物分型技術(shù)，最后通過對長江、黃河和遼河三個水系野生河蟹種群的遺傳結(jié)構(gòu)加以分析，以期獲得河蟹主產(chǎn)水系野生群體的當(dāng)前的種質(zhì)資源狀況，對河蟹遺傳育種工作提供基礎(chǔ)資料。
　　1.為優(yōu)化中華絨螯蟹基因組DNA提取方法，本試驗采用酚-氯仿法和吸附柱型試劑盒分別對中華絨螯蟹的鰓、肌肉、血淋巴液

3、和剛毛4種組織進(jìn)行DNA提取，并從純度、濃度、片段完整性及微衛(wèi)星標(biāo)記PCR擴增效果共4個方面評價提取DNA的質(zhì)量。結(jié)果顯示：使用酚-氯仿法提取得到的DNA片段比用試劑盒提取的更完整，且DNA的濃度較高，但純度稍低；兩種提取方法，剛毛和血淋巴液中的DNA純度都高于鰓和肌肉，4種組織中的DNA含量依次為鰓>肌肉>剛毛>血淋巴液，未剪碎剛毛中未能提取到基因組DNA；微衛(wèi)星標(biāo)記PCR產(chǎn)物的電泳條帶表明，兩種提取方法下4種組織中提取的DNA質(zhì)量均

4、可滿足微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用要求。最終建立起一種簡便的非損傷性中華絨螯蟹的采樣及其DNA提取方法，這對于進(jìn)行中華絨螯蟹遺傳育種和分子標(biāo)記研究等方面具有積極作用。
　　2.為對比熒光標(biāo)記分型技術(shù)和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對微衛(wèi)星等位基因分型的效果，本試驗選擇6對微衛(wèi)星引物，對60個中華絨螯蟹個體的總DNA分別進(jìn)行PCR擴增。熒光標(biāo)記法共檢測出等位基因129個，平均每個位點21.5個等位基因，聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測出等位基因174個，平均

5、每個位點29個等位基因。對位點Esin67的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行重復(fù)檢測，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記法的重復(fù)率為100％，而聚丙烯酰胺凝膠電泳法兩次結(jié)果存在較大差異，該結(jié)果證實了熒光標(biāo)記法在檢測的可靠性顯著的高于聚丙烯酰胺凝膠電泳。對兩種方法的檢測效率和經(jīng)濟成本的分析表明，熒光標(biāo)記法雖然成本較高，但效率亦高于聚丙烯酰胺凝膠電泳法。建立單重PCR產(chǎn)物的多重毛細(xì)管電泳分型技術(shù)是提高效率、降低成本的有效途徑。
　　3.利用23個微衛(wèi)星標(biāo)記，對3個水系（

6、長江、黃河、遼河）河蟹的野生群體進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。共檢測到745個等位基因，各位點平均等位基因數(shù)為31個。遺傳多樣性分析顯示，23個微衛(wèi)星座位的平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.894，其中22個為高多態(tài)性位點（PIC>0.5）。所有位點平均觀測雜合度為0.736，平均期望雜合度為0.903，有多個座位在不同群體中偏離哈代-溫伯格平衡，總體上處于雜合子缺失狀態(tài)。3個群體均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平（HO=0.725-0.752

7、，I=2.729-2.769）；香農(nóng)信息指數(shù)（I）顯示3群體的遺傳多樣性水平依次為：黃河群體>長江群體>遼河群體。AMOVA分析結(jié)果顯示，99.76%的變異來源于種群內(nèi)部和個體內(nèi)部，群體遺傳分化指數(shù)FST=0.0022-0.0056，群體間的遺傳分化處于較低水平(FST<0.05)?；贜ei’s遺傳距離的UPGMA聚類結(jié)果顯示，黃河群體和遼河群體聚為一支，長江群體單獨聚為一支。瓶頸效應(yīng)分析顯示，所有群體近期均經(jīng)歷了有效種群大小的降低。

8、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析未能成功劃分最佳理論群體數(shù)，表明3個野生群體均存在一定程度的基因混雜。對3個河蟹主產(chǎn)水系的野生群體進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明以下問題：河蟹3個主產(chǎn)水系的野生具有較高的遺傳多樣性，作為育種基礎(chǔ)群體進(jìn)行遺傳改良的潛力較大；地理種群間存在一定的遺傳分化，與地理距離呈現(xiàn)一定的相關(guān)性；3個群體較低的遺傳分化程度以及較為混亂的遺傳結(jié)構(gòu)，均暗示了養(yǎng)殖活動中的大規(guī)模跨地域引種以及養(yǎng)殖群體的逃逸等原因都可能會造成流域間天然河蟹種