Genistein抑制關節(jié)軟骨退化及作用機制研究.pdf

1、骨關節(jié)炎是一種發(fā)病率高、嚴重影響中老年人群生活質量的慢性退行性疾病。主要病理改變?yōu)殛P節(jié)軟骨組織退化,發(fā)病機制與基質金屬蛋白酶與金屬蛋白酶抑制物比例失衡,局部炎性介質產生增多,導致膠原纖維破壞、蛋白聚糖分解代謝增強有關。植物化學物質Genistein屬于黃酮類化合物,具有較強抗氧化、抗炎癥反應能力,對關節(jié)軟骨細胞炎性損傷有一定的保護作用。
　　 目的:本研究擬通過兔關節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng),并采用脂多糖干預誘導兔軟骨細胞損傷,以建立

2、體外模擬骨關節(jié)炎軟骨細胞生長模型。利用上述細胞模型,本研究將進一步觀察Genistein對經LPS處理的軟骨細胞活性、炎癥因子產生的調節(jié)作用,以了解Genistein對軟骨細胞的保護作用及可能機制。
　　 方法:
　　 第一部分:選取一月齡新西蘭兔,處死后在無菌條件下切取兔脛骨近端、股骨遠端及近端關節(jié)面軟骨,采取機械分離結合酶消化結合的方法獲取足量軟骨細胞,培養(yǎng)子15％胎牛血清的DMEM高糖型培養(yǎng)基,倒置顯微鏡下觀察細胞

3、形態(tài)及生長狀況,并采用化學染色及免疫組化染色對軟骨細胞進行鑒定。用脂多糖處理細胞,MMT實驗測定軟骨細胞活性,并采用試劑盒、RT-PCR方法檢測軟骨細胞損傷過程中相關炎癥介質一氧化氮(NO)、白介素-1β(IL-1β)的表達水平。
　　 第二部分:為進一步觀察Genistein對軟骨細胞的保護作用,穩(wěn)定傳代的細胞分為正常軟骨細胞組,脂多糖單獨處理組,脂多糖+雌激素處理組,脂多糖+不同劑量Genistein處理組(選取Genist

4、ein劑量為0.1μg/ml~25.0μg/ml)。根據MTY實驗繪制各組細胞生長曲線,比較軟骨細胞活性。提取各組細胞總RNA,經RT-PCR實驗測定相關炎性介質IL-1β、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、Ⅱ型膠原、P53基因的表達。
　　 結果:
　　 第一部分:在成功建立體外關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)體系基礎上,采用脂多糖處理細胞,造成細胞炎癥損傷模型,細胞增殖活性降低,NO產生增多、IL-1

5、β表達增高,提示體外模擬骨關節(jié)炎的軟骨細胞模型建立成功。
　　 第二部分:利用LPS誘導的體外關節(jié)軟骨細胞損傷模型觀察Genistein對軟骨細胞作用的實驗結果提示,LPS對軟骨細胞增殖活性產生顯著抑制作用。在處理早期,LPS能顯著刺激炎性介質IL-1β表達,并通過提高iNOS表達增加NO水平,對MMP-1和P53表達也有促進作用。對LPS誘導的軟骨細胞增殖活性受抑,Genistein未表現明顯逆轉作用,高劑量條件下表現為抑制細

6、胞增殖活性作用。低劑量Genistein與雌性激素處理組炎性介質IL-1β、iNOS、MMP-1、P53表達雖然仍高于正常軟骨細胞,但與LPS單獨處理相比,均表現為表達水平降低的特點。Ⅱ型膠原表達水平表現出穩(wěn)定甚至因為損傷因素呈現微弱增高的特點。
　　 結論:以脂多糖處理體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞能導致炎癥損傷,表現為細胞活性降低,炎性介質產生增多,可作為研究骨關節(jié)炎的較為理想的體外細胞模型。LPS作為損傷因素對軟骨細胞增殖活性產生

7、顯著抑制作用,結合對相關基因表達調節(jié)的結果,顯示了LPS在誘導炎癥反應、增加基質降解和誘導軟骨細胞凋亡方面的作用特點。對LPS已經造成的軟骨細胞損傷,Genistein對細胞增殖活性未表現明顯逆轉作用,但從調節(jié)基因表達結果看,低劑量Genistein與雌性激素類似,表現出降低炎性介質、減少iNOS生成、降低軟骨蛋白酶、抑制凋亡的特點。軟骨細胞特征性標志物Ⅱ型膠原表達水平維持正常或微弱增高的特點提示軟骨基質降解破壞增強是OA病理過程中更為