NOS抑制劑L-NMMA對關(guān)節(jié)軟骨損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(Posttraumatic osteoarthritis)是關(guān)節(jié)軟骨損傷繼發(fā)損傷的常見并發(fā)癥，臨床上以關(guān)節(jié)軟骨損傷后出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙，疼痛等一組綜合癥。臨床和流行病學(xué)研究顯示直接或間接的關(guān)節(jié)非生理性的撞擊，半月板，韌帶和關(guān)節(jié)囊的損傷，關(guān)節(jié)脫位，以及經(jīng)關(guān)節(jié)面的骨折均可引起關(guān)節(jié)軟骨的功能退變，增加創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率?；A(chǔ)研究證實(shí)機(jī)械應(yīng)力可引起關(guān)節(jié)軟骨的損傷，關(guān)節(jié)面的不平整，關(guān)節(jié)內(nèi)的應(yīng)力分布不均也可以引

2、起關(guān)節(jié)軟骨的退變，最終導(dǎo)致創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生。但是關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨損傷是如何引起繼發(fā)性創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，特別是各種不同程度的關(guān)節(jié)軟骨損傷后應(yīng)選用何種最佳方法處理和治療預(yù)防創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，到目前為止還沒有肯定有效的方法。 關(guān)節(jié)軟骨損傷可分為三種損傷方式，①關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)和細(xì)胞的損傷，軟骨下骨沒有損傷，②關(guān)節(jié)軟骨表面可見的裂隙或缺損，沒有波及軟骨下骨，此種損傷發(fā)生后，由于軟骨沒有血管，所以軟骨細(xì)胞也不能自行完全修復(fù)，是較難恢復(fù)的損傷③關(guān)節(jié)

3、軟骨和軟骨下骨的共同損傷，造成軟骨和骨結(jié)構(gòu)完整性破壞。由于損傷的嚴(yán)重程度不同，其修復(fù)的方式和預(yù)后也大不相同。特別是單純的軟骨基質(zhì)和細(xì)胞的損傷，由于發(fā)生頻率高，臨床診斷困難，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是一種具有多種生物學(xué)功能的無機(jī)小分子，在骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)中主要由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生，是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下產(chǎn)生。具有抑制軟骨細(xì)胞增殖、遷移、粘附；誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡；干擾軟骨細(xì)胞

4、與其周圍介質(zhì)的信息傳遞；促進(jìn)軟骨細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶和前列腺素E，加速軟骨基質(zhì)的崩解和炎癥過程；同時抑制軟骨基質(zhì)膠原和蛋白多糖的合成，增加基質(zhì)的分解，最終造成關(guān)節(jié)軟骨損傷。 L-單甲基精氨酸(NG-minomethyl-L-arginine；L-NMMA)是一種非特異的NOS抑制劑，能阻止關(guān)節(jié)內(nèi)NOS的合成，間接的抑制NO產(chǎn)生，緩解關(guān)節(jié)軟骨的破壞。研究證實(shí)L-NMMA能明顯抑制關(guān)節(jié)炎臨床癥狀， 降低血漿中的亞硝酸鹽，硝酸鹽水

5、平。但是L-NMMA對軟骨細(xì)胞的凋亡有無抑制作用，對關(guān)節(jié)軟骨損傷后繼發(fā)的創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎有無防治效果作用有待進(jìn)一步研究。 正是由于以上的原因，有必要在關(guān)節(jié)軟骨損傷模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究NO在關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞和軟骨細(xì)胞凋亡中的作用，為預(yù)防繼發(fā)性關(guān)節(jié)軟骨破壞，恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨正常生理功能提供理論基礎(chǔ)。同時探討L-NMMA對直接軟骨損傷后軟骨細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步預(yù)防創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎尋找新的方法。 目的： 1．通過建立的關(guān)

6、節(jié)軟骨損傷模型，研究關(guān)節(jié)軟骨損傷后其繼發(fā)性病理變化，探討創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)理。 2．研究一氧化氮合酶抑制劑L-NMMA對關(guān)節(jié)軟骨損傷后的軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 材料與方法： 1．采用由華西醫(yī)院骨科自行設(shè)計(jì)的自由落體撞擊模型，在體內(nèi)建立不同程度關(guān)節(jié)軟骨損傷的動物模型。 2．70只健康成年新西蘭大白兔，隨機(jī)分配到高(6.3J)、低(0.9J)能量撞擊組和對照組，高、低每組28只，

7、一側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，術(shù)后隨機(jī)分為1周、2周、3周、4周、8周、12周、16周七個組，每個時間組4只動物。對照組14只，每個時間組2只。每時間組觀察期滿后取材，采用HE染色、TUNEL法、流式細(xì)胞儀、透射電鏡、番紅O染色等方法分別觀察不同能量造成關(guān)節(jié)軟骨損傷后軟骨細(xì)胞的凋亡，應(yīng)用化學(xué)比色法測定關(guān)節(jié)液中NO與NOS的含量，應(yīng)用免疫組化的方法測定受損軟骨細(xì)胞Bax和bcl-2凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步研究軟骨細(xì)胞的凋亡變化。 3．10只健康成年

8、新西蘭大白兔，高能量(6.3J)撞擊左側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁，分為兩組6只行每12小時皮下注射L-NMMAlomg／kg，傷后48小時后再強(qiáng)化注射一次。4只行皮下生理鹽水3ml／kg，傷后48小時后再強(qiáng)化注射一次。于最后注射時間4周后處死動物，取材。用HE染色、nYNEL，法、Bax免疫組化等方法分別觀察軟骨細(xì)胞的凋亡改變。 結(jié)果： ． (1)低能量撞擊后HE染色觀察軟骨無裂隙，細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)清晰，鈣化層緊貼軟骨下骨板未見骨折

9、，潮線清晰。掃描電鏡觀察，軟骨膠原纖維網(wǎng)架完好，未見變形及斷裂。高能量撞擊后HE染色觀察，軟骨出現(xiàn)裂隙，但未涉及鈣化層與軟骨下骨，掃描電鏡觀察，在移形層和輻射層均發(fā)現(xiàn)有膠原網(wǎng)架變形并有斷裂。 (2)高、低能量組在傷后早期軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，并具有顯著性差異。低能量組中，傷后4周軟骨細(xì)胞凋亡率恢復(fù)到對照組水平。高能量組軟骨細(xì)胞凋亡率逐漸增高。 (3)高低能量組在傷后早期受損傷的關(guān)節(jié)液中NO與NOS的含量明顯增高，

10、高于對照組，并具有顯著性差異，低能量組在傷后短期內(nèi)恢復(fù)到對照組水平，而高能量組關(guān)節(jié)液NO與NOS含量逐漸增高。 (4)低能量組中，傷后早期軟骨細(xì)胞Bax陽性細(xì)胞率增高與對照組有顯著性差異。4周后恢復(fù)到對照組水平。高能量組中，1、2周時軟骨細(xì)胞Bax陽性細(xì)胞率增高與對照組有顯著性差異，4周時軟骨細(xì)胞Bax陽性細(xì)胞率明顯上升，傷后時間越長，陽性細(xì)胞率越高，與對照組有顯著性差異。 (5)低能量組中，傷后早期軟骨細(xì)胞bcl-2陽

11、性細(xì)胞數(shù)與對照組無明顯差異。高能量組中，1周、2周、3周組軟骨細(xì)胞bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)與對照組有明顯差異；4周后與低能量組、對照組相比有顯著性差異。 (6)高能量(6.3J)撞擊關(guān)節(jié)軟骨損傷后，采用皮下注射一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)后，關(guān)節(jié)液NO與NOS含量明顯下降，軟骨細(xì)胞的凋亡率與對照組相比明顯下降，Bax陽性細(xì)胞率與對照組相比明顯降低，bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比均明顯增高。 結(jié)論： (1)本

12、研究第一部分驗(yàn)證了直接撞擊兔的股骨內(nèi)側(cè)髁造成關(guān)節(jié)軟骨損傷是研究關(guān)節(jié)軟骨損傷和創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎較好的實(shí)驗(yàn)動物模型，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的動物模型。 (2)本研究第二部分研究了不同程度關(guān)節(jié)軟骨損傷后軟骨的病理學(xué)改變首次在兔關(guān)節(jié)軟骨損傷模型中有以下兩種發(fā)現(xiàn)： ①低能量(0.9J)撞擊后早期出現(xiàn)關(guān)節(jié)液中NO與NOS含量和軟骨細(xì)胞凋亡率增高，由于軟骨膠原纖維網(wǎng)架完好，傷后4周即恢復(fù)到對照組水平。4周后，軟骨細(xì)胞Bax與bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)

13、與對照組相比較無明顯差異。結(jié)果表明，膠原纖維網(wǎng)架完好的關(guān)節(jié)軟骨損傷具有限的自行修復(fù)能力。 ②高能量(6.3J)撞擊后由于軟骨出現(xiàn)裂隙、膠原纖維網(wǎng)架變形和斷裂，隨傷后時間延長關(guān)節(jié)液中NO與NOS的含量和軟骨細(xì)胞凋亡率逐漸增高，并發(fā)現(xiàn)二者之間有明顯的相關(guān)性。軟骨細(xì)胞的Bax陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)持續(xù)顯著上升，bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)也呈上升趨勢，與對照組相比，有明顯的差異。結(jié)果表明，膠原纖維網(wǎng)架變形和斷裂的關(guān)節(jié)軟骨損傷后不能自行修復(fù)，傷后4周退