內(nèi)源性NOS抑制劑ADMA抗谷氨酸損傷PC12細(xì)胞的作用及其機(jī)制.pdf

1、【研究背景】
　　谷氨酸(Glutamate, Glu)興奮性神經(jīng)毒性在缺氧-缺血性腦損傷和各種慢性退行性神經(jīng)病變中起重要作用。如何減輕 Glu興奮性毒性對上述疾病的治療具有重要意義。研究表明,谷氨酸的興奮性毒性與一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的過度活化、一氧化氮(Nitric oxide, NO)的生產(chǎn)增加密切相關(guān)。
　　非對稱性二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylar

2、ginine, ADMA)是一種廣泛參與多種病理生理過程的內(nèi)源性競爭性 NOS抑制劑。ADMA除能通過抑制NOS活化,減少NO生成外,還能通過誘導(dǎo)NOS失耦聯(lián),增加氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成、造成氧化應(yīng)激損傷。
　　在Glu興奮性毒性損傷過程中,ADMA是通過抑制NOS活化、減少NO生成,減輕興奮性神經(jīng)毒性,還是通過增加ROS生成,加重興奮性神經(jīng)毒性,尚無報道。
　　【目的】

3、r>　　本試驗以Glu損傷PC12細(xì)胞作為Glu興奮性神經(jīng)毒性的體外模型,探討ADMA對Glu興奮性神經(jīng)毒性作用的影響及其機(jī)制。
　　【方法】
　　1)四甲基偶氮唑藍(lán)(3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide, MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖狀況;
　　2)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放試驗評價細(xì)胞損傷程

4、度;
　　3)羅丹明123(Rhodamine123, Rh123)染色,熒光顯微鏡攝片及流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry, FCM)檢測細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP);
　　4)雙氫羅丹明(Dihydrorhodamin123, DHR)染色,熒光顯微鏡攝片及FCM檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平;
　　5)NOS檢測試劑盒測定細(xì)胞NOS活性;
　　6

5、)NO檢測試劑盒測定細(xì)胞NO的生成。
　　【結(jié)果】
　　1. Glu對PC12細(xì)胞的興奮性毒性作用及其機(jī)制
　　1) PC12細(xì)胞分別與0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM和6 mM Glu共培養(yǎng)24 hrs,MTT法檢測細(xì)胞活力顯示,在1 mM~6 mM Glu范圍內(nèi),細(xì)胞存活率隨藥物濃度增加而逐漸降低,呈劑量依賴性關(guān)系。
　　2)1 mM、2 mM、4 mM Glu處理PC12細(xì)胞24 hrs,細(xì)胞LD

6、H釋放增加。
　　3)2 mM Glu處理4 hrs,MMP明顯降低。
　　4)2mM Glu處理4 hrs,細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加。
　　5)Glu處理4 hrs,可使PC12細(xì)胞NOS活性增加,1 mM Glu組NOS活性提高了0.6倍,2 mM Glu組NOS活性提高了1倍,4 mM Glu組NOS活性沒有繼續(xù)升高。
　　6)Glu作用4 hrs,可使PC12細(xì)胞NO生成量增加,1 mM Glu組NO生成

7、量增加0.7倍,2 mM Glu組NO生成量增加2倍,4 mM Glu組NO生成量不再繼續(xù)增加。
　　2. ADMA抗Glu興奮性毒性的作用及其機(jī)制
　　1)ADMA(20~320μM)對PC12細(xì)胞無明顯的毒性作用。
　　2)不同濃度Glu處理PC12細(xì)胞前30 mins,分別給予20μM、40μM ADMA預(yù)處理可以對抗1 mM、2 mM和4 mM Glu引起的細(xì)胞存活率降低。
　　3)20μM ADMA預(yù)處

8、理可以抑制1、2和4 mM Glu引起的細(xì)胞LDH釋放。
　　4)20μM ADMA預(yù)處理可改善2 mM Glu引起的MMP降低。
　　5)20μM ADMA預(yù)處理可減少2 mM Glu誘導(dǎo)的ROS堆積。
　　6)20μM、40μM ADMA預(yù)處理可抑制2 mM Glu增加細(xì)胞NOS活性。
　　7)20μM、40μM ADMA預(yù)處理可抑制2 mM Glu促進(jìn)NO生成。
　　【結(jié)論】
　　ADMA對Gl