PI3K-Akt信號通路介導骨髓間充質(zhì)干細胞來源的膜微囊對谷氨酸損傷PC12細胞的保護.pdf

1、南方醫(yī)科大學2 0 1 1 級碩士學位論文P 1 3 K ／A k t 信號通路介導骨髓間充質(zhì)干細胞來源的膜微囊對谷氨酸損傷P C I 2 細胞的保護B 0 n e m a r r o W m e S e n C n V m a I s t e m c e l l - d e r i v e o m i c r o v e s i c l e s1 h ' ■· _ ’ 1 ‘ l ● - ’p r o t e c t

2、 r a t p h e o c h r o m o c y t o m a P C 1 2c e l l sf r o mg l u t a m a t e ．i n d u c e d 。。u r y v i a a P 1 3 K ／A k td e l 3 e n d e n t u c el n l u 1 3 e n— l J 量U A K t課題來源：導師指定學位申請人導 師 姓 名專 業(yè) 名 稱培 養(yǎng) 類 型培 養(yǎng) 層

3、次所 在 學 院答辯委員會主席p a t h w a y林珊珊黃國志教授、主任康復(fù)醫(yī)學與理療學專業(yè)型碩士研究生第二臨床醫(yī)學院黃東鋒教授答辯委員會委員 范建中教授石堅 教授郭蘭 教授吳文 教授2 0 1 4 年 月 日 廣州摘要人們發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮作用的機制并非簡單局限在移植后定向遷徙到損傷部位，與宿主細胞發(fā)生整合，或分化并替代損傷細胞，而更有可能與移植間充質(zhì)干細胞能夠分泌多種營養(yǎng)因子及釋放出含遺傳信號和／或營養(yǎng)物質(zhì)的膜微囊等物質(zhì)有關(guān)。【目的】

4、通過將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源的膜微囊( r B M S C ．M V ) 作用于谷氨酸興奮性損傷的P C I 2 細胞模型，驗證r B M S C ．M V 對P C I 2 細胞存活、抵御谷氨酸興奮性損傷的作用，以及M V 、谷氨酸共同作用于P C I 2 細胞后，對細胞p - A k t 、B c l ．2 、B a x 、c a s p a s e 一3 等信號通路相關(guān)蛋白表達的影響，探究r B M S C ．M V 對神經(jīng)興奮

5、性損傷的保護作用及其可能的相關(guān)機制。【方法】1 ．r B M S C 提取、培養(yǎng)與鑒定從S D 大鼠中提取r B M S C 并進行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。利用特定誘導劑誘導后對r B M S C 成骨、成脂分化能力進行鑒定；利用流式細胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細胞特異性表面標志C D 2 9 、C D 3 1 、C D 3 4 、C D 4 4 、C D 4 5 。2 ．膜微囊的制備、提取與鑒定選擇傳代至3 ～5 代的B M S C 進

6、行低氧處理。細胞貼壁并生長融合至7 0 - - 8 0 ％時，吸棄原培養(yǎng)基，用P B S ( 磷酸鹽緩沖液) 或無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2 ～3 遍。隨后，將培養(yǎng)基更換成新鮮培養(yǎng)基，將細胞放入含1 ％0 2 、5 ％C 0 2 的低氧培養(yǎng)箱中處理7 2 h 。低氧完成后，無菌條件下收集細胞上清，差速離心法去除其中含有的死細胞、細胞碎片等，再經(jīng)0 ．2 2 l x m 的濾膜過濾，在4 “ C ，1 0 0 ，0 0 0 x g條件下，進行超

7、速離心l h 后再重復(fù)超速離心一次，以提取純凈的M V 。用一定體積的P B S 重懸M V 后，．8 0 ℃保存。根據(jù)B r a d f o r d 蛋白定量法測定M V 相關(guān)的蛋白濃度。電子顯微鏡下觀察r B M S C ．M V 形態(tài)，并用流式細胞術(shù)對r B M S C ．M V 表面標記進行鑒定。3 。P C I 2 細胞谷氨酸損傷模型的制備將濃度分別為0 ，O ．5 m M ，l m M ，5 m M ，1 0 m M 的谷氨