人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源膜微囊的途徑探索.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）由于其較強(qiáng)的再生能力，免疫調(diào)節(jié)功能及多向分化的潛能被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中，同時(shí)為缺血性心肌病的治療帶來(lái)了新的希望。然而，其具體的作用機(jī)制仍不清楚。近期大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSC進(jìn)入體內(nèi)后，絕大多數(shù)細(xì)胞由于體內(nèi)存在的排斥反應(yīng)和不適應(yīng)機(jī)體內(nèi)缺血缺氧的微環(huán)境在72小時(shí)內(nèi)死亡，但是能顯著改善心功能。那么，死亡的MSC是如何發(fā)揮作用的呢？我們的前期研究表明，MSC在低氧

2、低營(yíng)養(yǎng)的條件下可釋放大量膜微囊(microvesicles，MVs)，而且MV體外可內(nèi)化入內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)其增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，體內(nèi)也能促進(jìn)缺血肢體血管新生。因此，至少在促進(jìn)血管新生方面，MV可能是MSC發(fā)揮作用的主要介質(zhì)。在上述過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化MV是關(guān)鍵的步驟。然而，MSC來(lái)源的MV(MSC-MV)通過(guò)何種途徑進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，至今未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)告。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　膜微囊是細(xì)胞在激活或凋亡過(guò)程中釋放的一種囊泡結(jié)構(gòu)，

3、其可攜帶母細(xì)胞的遺傳信息傳遞給靶細(xì)胞，被認(rèn)為是細(xì)胞間信息傳遞的重要介質(zhì)。通過(guò)對(duì)其內(nèi)化機(jī)制的研究可以為干細(xì)胞的臨床治療機(jī)制和膜微囊替代干細(xì)胞治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.利用密度梯度離心及差速貼壁的方法，分離純化人骨髓MSC（BMSC），并通過(guò)形態(tài)觀察、體外成骨和成脂肪能力以及細(xì)胞表型，對(duì)BMSC進(jìn)行鑒定。
　　2.經(jīng)鑒定后的BMSC，在1％氧及無(wú)血清條件下誘導(dǎo)其凋亡，獲取細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)超速離心分離

4、得到BMSC-MV，并通過(guò)電鏡對(duì)其形態(tài)進(jìn)行鑒定，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MV表面標(biāo)志物的表達(dá)，以確定BMSC-MV的來(lái)源及其基本特征。同時(shí)，用CFSE或DiI熒光染料對(duì)BMSC-MV進(jìn)行標(biāo)記觀察BMSC-MV內(nèi)化，。
　　3.以人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為對(duì)象，用抗人的CD29和CD44抗體，和/或重組人膜聯(lián)蛋白V（Anx-V）預(yù)處理后的BMSC-MV后與HUVEC共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微術(shù)評(píng)價(jià)BMSC-MV內(nèi)化情況。此外，利用

5、干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染HUVEC，以特異抑制 Anx-V和磷脂酰絲氨酸受體（PSR）表達(dá)，進(jìn)一步觀察BMSC-MV內(nèi)化的改變。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離BMSC，并在特定誘導(dǎo)條件下，可分化為成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示其表面高表達(dá)CD73，CD44，不表達(dá)CD45和CD31。
　　2.成功分離獲取BMSC-MV，并通過(guò)流式檢測(cè)證明其表面高表達(dá)與BMSC相同的表面分子CD73，CD44，不表達(dá)CD45和

6、CD31。同時(shí)高表達(dá)CD29，磷脂酰絲氨酸（PS）。
　　3.HUVEC可內(nèi)化BMSC-MV，并存在一定的時(shí)間及濃度依賴性效應(yīng)，通過(guò)CD29，CD44抗體及外源性重組人Anx-V可以封閉BMSC-MV表面的相應(yīng)的分子CD29，CD44，PS抑制其內(nèi)化。siRNA干擾HUVEC表面的Anx-V后，BMSC-MV內(nèi)化未見(jiàn)明顯變化；干擾PSR合成后BMSC-MV的內(nèi)化顯著減少。
　　結(jié)論：
　?。?）在低氧低營(yíng)養(yǎng)的條件下，人