PI3K-Akt-FoxO3a通路在文拉法辛保護(hù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、研究背景：抑郁癥(depression)是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙(mood disorders)或情感性障礙(affective disorders)，是臨床最常見(jiàn)的精神疾患之一，其發(fā)病率僅次于精神分裂癥，該病是一種情感性精神障礙，臨床表現(xiàn)以顯著而持久的心境低落為主，并有相應(yīng)的思維和行為改變。如思維遲緩，言語(yǔ)動(dòng)作減少等，并伴隨有食欲降低、性欲減退、睡眠障礙等軀體癥狀。后果更為嚴(yán)重時(shí)約有15％的抑郁癥患者有自殺傾向

2、，抑郁癥正在成為威脅人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾患。據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新資料顯示，到了2020年，抑郁癥將成為僅次于癌癥的人類(lèi)第二大殺手，而對(duì)于中國(guó)來(lái)說(shuō)，抑郁癥將成為中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)最重的第二大疾病。自傷、自殘、自殺及擴(kuò)大性自殺者中，75％～85％為患有抑郁癥患者所為?？梢哉f(shuō)，目前抑郁癥已成為中國(guó)三大公共衛(wèi)生健康問(wèn)題之一。對(duì)抑郁癥機(jī)制的研究中抑郁癥發(fā)病的單胺假說(shuō)是目前為大多數(shù)人接受的一種理論，單胺假說(shuō)的發(fā)現(xiàn)是最初是從藥理學(xué)的研究中得到啟示的。能提高中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)功能或提高它們?cè)谏窠?jīng)突觸問(wèn)隙的濃度的藥物都有改善情緒治療抑郁癥狀的作用。因此，專(zhuān)家認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)生與突觸內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的降低有直接關(guān)系；但是隨著更多臨床研究發(fā)現(xiàn)，單胺學(xué)說(shuō)不能解釋抗抑郁藥能在給藥數(shù)小時(shí)后增加神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間隙的濃度，但抗抑郁的療效卻在連續(xù)治療2-4周才開(kāi)始出現(xiàn)的現(xiàn)象。單胺假說(shuō)已不足以解釋臨床研究中的疑問(wèn)，因此，人們提出了其他一些假說(shuō)。
　　 慢性抑郁癥患者的MRI(Magnetic Res

4、onance Imaging，磁共振成像，MRI)結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些大腦區(qū)域傾向于比正常人的相應(yīng)區(qū)域?。粍?dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明抗抑郁藥能夠保護(hù)由于應(yīng)激造成的海馬體積縮小，海馬體積的縮小極有可能是由于海馬神經(jīng)元的萎縮，研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激過(guò)程中糖皮質(zhì)激素水平的升高是海馬神經(jīng)元損傷的主要原因，應(yīng)激導(dǎo)致的HPA軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，下丘腦-垂體-腎上腺軸)紊使體內(nèi)皮質(zhì)醇水平的增加，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元功能障礙和結(jié)構(gòu)

5、改變，甚至發(fā)生神經(jīng)元變性和死亡，如抑郁癥發(fā)生后興奮性氨基酸谷氨酸堆積，導(dǎo)致神經(jīng)元變性，引起海馬神經(jīng)元的凋亡和死亡，甚至出現(xiàn)大腦功能形態(tài)損害。而抗抑郁藥很可能是通過(guò)增加生長(zhǎng)和存活促進(jìn)因子如BDNF(Brain-derived neurotrophic factor，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子)的表達(dá)而阻止或逆轉(zhuǎn)海馬神經(jīng)元的萎縮和損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)其治療作用。研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥的慢性治療可上調(diào)BDNF及其受體trkB(Tropomyosin-related

6、receptor B，原肌球蛋白相關(guān)受體B)的表達(dá)從而加強(qiáng)海馬神經(jīng)元生成，促進(jìn)神經(jīng)元分枝并阻止萎縮。因此，抗抑郁藥極有可能使通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元損傷，改善抑郁癥患者腦區(qū)器質(zhì)性病變，從而達(dá)到抗抑郁作用。因此，本課題主要從抗抑郁藥的神經(jīng)保護(hù)作用出發(fā)，探討抗抑郁藥可能的作用機(jī)制。
　　 研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥能夠通過(guò)cAMP(cyclic adenosine monophosphate，環(huán)磷酸腺苷通路)、PI(phosphatidylinosit

7、ol，磷脂酰肌醇)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)以及各種生化物質(zhì)影響PI3K/Akt(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase B 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)通路，而FoxO(Forkhead box,sub-group“O”，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子)作為PI3K/Akt通路的下游轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，增殖，存活以及氧化應(yīng)激等方面起著重要的作用，因此，本課題以皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模擬抑郁癥細(xì)胞模型，

8、觀察抗抑郁藥文拉法辛對(duì)抗由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及PI3K/Akt/FoxO3a通路是否參與了文拉法辛的保護(hù)作用。
　　 研究目的：
　　 1、觀察文拉法辛對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 2、觀察文拉法辛保護(hù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的可能信號(hào)通路。
　　 3、觀察文拉法辛對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷過(guò)程中FoxO3a、Akt蛋白磷酸化表達(dá)的影響。
　　 4、觀察

9、文拉法辛保護(hù)作用是否是通過(guò)PI3K/Akt通路發(fā)揮作用的。
　　 5、觀察皮質(zhì)酮以及文拉法辛對(duì)FoxO3a的亞細(xì)胞定位的影響。
　　 研究方法:
　　 1、建立由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，觀察文拉法辛對(duì)細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用，分為正常組，模型組，文拉法辛給藥組，采用MTT assay，Hoechst stain檢測(cè)細(xì)胞存活率以及細(xì)胞狀態(tài)；Western Blot檢測(cè)FoxO3a、Akt等蛋白磷酸化水平。<

10、br>　　 2、采用通路阻斷劑預(yù)處理，觀察皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型以及文拉法辛對(duì)細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用是否有所改變，采用MTT assay，Hoechst stain檢測(cè)細(xì)胞存活率以及細(xì)胞狀態(tài)；Western Blot 檢測(cè)FoxO3a、Akt等蛋白磷酸化水平。
　　 3、PC12細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-FoxO3a質(zhì)粒，采用皮質(zhì)酮以及文拉法辛進(jìn)行處理，觀察不同情況FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位。
　　 研究結(jié)果

11、:
　　 1.皮質(zhì)酮能夠劑量依賴(lài)性的誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，Hoechst33342熒光染色觀察皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響，以細(xì)胞萎縮、核固縮、染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成和熒光強(qiáng)度增強(qiáng)等作為凋亡細(xì)胞指征，與正常組相比，模型組細(xì)胞狀態(tài)多見(jiàn)核染色質(zhì)濃縮密集，邊緣化，形成深染團(tuán)塊呈新月?tīng)罨蚪渲笭睿挥诤四は?，核破裂出芽形成凋亡小體等細(xì)胞凋亡及死亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。MTT結(jié)果以及熒光染色結(jié)果顯示，與模型組相比，文拉法辛給藥組細(xì)胞明顯逆轉(zhuǎn)

12、由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，凋亡以及壞死細(xì)胞明顯減少。
　　 2.westem blot結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮處理能夠劑量和時(shí)間依賴(lài)性降低Akt、FoxO3a的磷酸化水平，文拉法辛給藥后能夠逆轉(zhuǎn)這種作用，升高磷酸化水平，發(fā)揮促存活作用。
　　 3.采用各通路阻斷劑預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)文拉法辛對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并且明顯改變由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Akt、FoxO3a磷酸化水平的改變，而其他通路

13、抑制劑變化不明顯，說(shuō)明文拉法辛對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用部分是通過(guò)PI3K/Akt通路發(fā)揮作用的。
　　 4.采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-FoxO3a質(zhì)粒，結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮處理能夠明顯增加FoxO3a的核轉(zhuǎn)位，說(shuō)明磷酸化水平降低；文拉法辛給藥后能夠促進(jìn)FoxO3a的胞漿轉(zhuǎn)位，磷酸化水平增加，促凋亡作用被抑制從而發(fā)揮促存活結(jié)果。
　　 結(jié)論: PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路參與了文拉法辛對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞