富血小板血漿激活PI3K-AKT-NF-kappa-B信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞再生及修復(fù)功能的相關(guān)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前再生醫(yī)學(xué)及組織工程中應(yīng)用廣泛并且最有潛力的治療手段。然而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比較難以獲得，并且在移植入體內(nèi)后常常大量死亡，存活率低下，這是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床及再生醫(yī)學(xué)中大量使用的最大限制。本課題著重研究了富血小板血漿（一種自體源性的復(fù)合生長因子）對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用。富血小板血漿通過激活PI3K-AKT-NFκB信號(hào)通路，降低了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在惡劣環(huán)境條件的凋亡，促進(jìn)了其存活率及其再生的功能。這些作用都是通

2、過促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌功能完成的。
　　 本課題分體外及體內(nèi)兩大部分。體外實(shí)驗(yàn)部分主要是通過體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，研究富血小板血漿對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抗凋亡的作用及其抗凋亡的機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要研究富血小板血漿處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入皮膚缺損創(chuàng)面后，在體內(nèi)的存活及其對(duì)創(chuàng)面的再生愈合（表皮，真皮，血管等）促進(jìn)作用。
　　 第一部分、（離體）富血小板血漿激活內(nèi)在機(jī)制對(duì)抗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡
　　 目的：研究離

3、體氧化應(yīng)激狀態(tài)下，富血小板血漿對(duì)抗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其存活的現(xiàn)象，同時(shí)探討其內(nèi)在的機(jī)制。
　　 方法：
　　 體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激條件——血清饑餓后雙氧水處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，MTT毒性檢測(cè)誘導(dǎo)的最佳條件及富血小板血漿的最佳濃度;在最佳誘導(dǎo)條件下，進(jìn)一步研究富血小板血漿對(duì)骨髓間充質(zhì)的抗凋亡作用，主要采取凋亡檢測(cè)、TUNEL染色方法驗(yàn)證細(xì)胞凋亡和凋亡率及TYPAN blue染色法排除細(xì)胞存活及存活率;同時(shí)研究凋亡蛋白B

4、cl-xl及p-Bad的表達(dá)情況。為深入探討其抗凋亡機(jī)制，采用免疫細(xì)胞化學(xué)及ELASA實(shí)驗(yàn)證明富血小板血漿是否具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌的作用---主要研究生長因子VEGF和PDGF;同時(shí)檢測(cè)到富血小板血漿對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面受體PDGFR的表達(dá)的影響;采用RT-PCR，Western blot，免疫細(xì)胞化學(xué)深入研究了富血小板血漿是否激活了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路PI3K-AKT-NFκB或JAK/STAT3;通過反證法，阻斷

5、PDGFR、PI3K、AKT，(LY294002，AG1295，SC66)研究富血小板血漿對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一系列的作用:包括抗凋亡，促進(jìn)旁分泌等作用是否改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、10um/ml的H2O2是體外最佳誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的條件;10％PRP及20％PRP是促進(jìn)增殖的最佳濃度;
　　 2、通過MTT，APOPTOSIS，TUNEL，TYPAN BLUE等檢測(cè)證明了PRP的有效抗凋亡的作用，以10％或者

6、20％的濃度為最佳;
　　 3、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的凋亡蛋白，PRP預(yù)處理后的MSC其Bcl-xl表達(dá)增高同時(shí)p-Bad表達(dá)降低，進(jìn)一步證明PRP的抗凋亡作用;
　　 4、深入研究PRP發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)MSC的旁分泌的作用(—)VEGF及PDGF的表達(dá)都增高;并同時(shí)檢測(cè)MSC的表面受體PDGF的表達(dá)相應(yīng)增高;
　　 5、PRP預(yù)處理激活了信號(hào)通路PI3K-AKT-NFκB;6、阻斷整個(gè)信號(hào)通路，PRP的抗凋亡，促進(jìn)分泌作用都明

7、顯降低甚至逆反。
　　 結(jié)論：10％PRP預(yù)處理促進(jìn)MSC在體外氧化應(yīng)激條件下（10um/mlH2O2+血清剝奪）抗凋亡的作用，這種抵抗凋亡作用的機(jī)制源于激活MSC內(nèi)在信號(hào)通路PI3K-AKT-NFκB，同時(shí)促進(jìn)MSC分泌VEGF及PDGF的作用。
　　 第二部分、研究體內(nèi)移植富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)存活情況及其再生修復(fù)作用
　　 目的：研究富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)存活及對(duì)急性

8、全層皮膚創(chuàng)面缺損的修復(fù)及再生能力。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物模型的建立及分組:SD雄性大鼠24只，8周齡。隨機(jī)分為三組。頭一天晚上各組動(dòng)物禁食，晨起，備皮。甲苯噻嗪（20mg/kg）及克他命（100mg/kg）麻醉。半小時(shí)后，手術(shù)剪在大鼠背部中央剪去約2.0×2.0cm大小的皮膚組織，制作皮膚全層缺損模型。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如下，第一組:實(shí)驗(yàn)組，皮下移植富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;第二組:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，移植骨髓

9、間充質(zhì)干細(xì)胞，（無富血小板血漿處理）;第三組:空白對(duì)照組，生理鹽水處理。各組細(xì)胞或鹽水量均為200ul.細(xì)胞濃度為5×106/ml。移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為大鼠來源的GFP陽性MSC。
　　 2.體內(nèi)移植后檢測(cè)細(xì)胞的存活率及GFP陽性細(xì)胞檢測(cè):分別于創(chuàng)面愈合的第1，3，5，7，12，22天取下全層皮膚包括皮下筋膜及肌肉，制作標(biāo)本。一半用于GFP陽性細(xì)胞檢測(cè)。同時(shí)運(yùn)用活體動(dòng)物成像儀檢測(cè)創(chuàng)面熒光信號(hào)強(qiáng)度。另一半，用于TUNEL染色，

10、檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)凋亡情況。
　　 3.創(chuàng)面愈合情況的檢測(cè)及顯微鏡下組織的愈合狀況:創(chuàng)面愈合情況每隔3天觀察一次，并用數(shù)碼相機(jī)拍照，計(jì)算機(jī)處理圖像信息，運(yùn)用面積計(jì)算法計(jì)算每次觀察愈合率的情況，創(chuàng)面愈合率=（初始面積一觀察面積）/初始面積×100％。微觀組織愈合率的評(píng)估采用馬松染色法，然后在顯微鏡下觀察其創(chuàng)面愈合情況（表皮、真皮愈合）。
　　 4.檢測(cè)表皮再生情況及創(chuàng)面生長因子檢測(cè):取第7天及22天的皮膚樣品，制作

11、冰凍切片。lOμm厚度。冰甲醇固定1小時(shí)后，0.1％triton X-1OO打孔30分鐘。然后一抗孵育組織切片1小時(shí):（小鼠抗大鼠a-SMA，VEGF兔抗大鼠CK5，PDGF);熒光標(biāo)記二抗(Alexa Fluor488-conjugated donkey anti-mouse andFITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG)孵育1-2小時(shí)。最后DAPI(Sigma Aldrich)復(fù)染后，熒光顯微鏡

12、下觀察。隨機(jī)選取10個(gè)中間區(qū)域進(jìn)行鏡下評(píng)估。
　　 5.機(jī)制探討:免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)各組切片信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。同樣取7天及22天的組織，4μm厚度標(biāo)本制作后，福爾馬林固定，石蠟包埋，梯度脫水后，烘干?？乖迯?fù)半小時(shí)，3％雙氧水處理切片，PBS反復(fù)漂洗4-5次后，一抗孵育:rabbit anti-rat p-AKT1，p-PI3K，NF-κB(1:100; EPITOMICS，Abcam)，4度，過夜。第二天，運(yùn)用辣根過

13、氧化物酶標(biāo)記的二抗:horseradishperoxidase-coupled goat anti-rabbit IgG(1:1000; Santa Cruz)孵育1-2小時(shí)。 PBS洗4-5次，最后蘇木精復(fù)染。樹膠封片。顯微鏡下觀察。對(duì)比各組蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活率較單獨(dú)移植的干細(xì)胞的存活率明顯升高，凋亡率相應(yīng)降低。
　　 2.富血小板血漿組跟

14、其余兩組對(duì)比，創(chuàng)面愈合率明顯升高，組織愈合時(shí)間明顯縮短;在細(xì)胞移植后第16天，創(chuàng)面幾乎完全愈合。而其余兩組動(dòng)物創(chuàng)面的愈合率在每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)均與富血小板組相比明顯低下，并且愈合時(shí)間偏長。微觀組織愈合狀況:富血小板血漿組，表皮再生情況明顯較其余兩組好，真皮膠原纖維排列規(guī)整，膠原粗大。
　　 3.富血小板血漿組明顯促進(jìn)創(chuàng)面表皮再生:增強(qiáng)血管再生及密度，（免疫熒光顯示a-SMA及CK5的表達(dá)明顯比其余兩組高）;并且創(chuàng)面生長因子濃度VEGF，

15、PDGF也明顯比其余兩組高。
　　 4.信號(hào)蛋白的檢測(cè):富血小板血漿組信號(hào)通路蛋白的表達(dá)比其余兩組高。這跟體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互呼應(yīng)。證明了體外實(shí)驗(yàn)的假設(shè)即:富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的生命力和再生能力，并且這種抗凋亡及再生的功能與其細(xì)胞內(nèi)的PI3K-AKT-NF-KB信號(hào)通路被激活密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入全層缺損的大鼠創(chuàng)面后，具有較好的存活率，能