富血小板血漿激活PI3K-AKT-NF-kappa-B信號通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞再生及修復(fù)功能的相關(guān)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞是目前再生醫(yī)學(xué)及組織工程中應(yīng)用廣泛并且最有潛力的治療手段。然而，骨髓間充質(zhì)干細胞比較難以獲得，并且在移植入體內(nèi)后常常大量死亡，存活率低下，這是骨髓間充質(zhì)干細胞在臨床及再生醫(yī)學(xué)中大量使用的最大限制。本課題著重研究了富血小板血漿（一種自體源性的復(fù)合生長因子）對骨髓間充質(zhì)干細胞的作用。富血小板血漿通過激活PI3K-AKT-NFκB信號通路，降低了骨髓間充質(zhì)干細胞在惡劣環(huán)境條件的凋亡，促進了其存活率及其再生的功能。這些作用都是通

2、過促進骨髓間充質(zhì)干細胞的旁分泌功能完成的。
　　 本課題分體外及體內(nèi)兩大部分。體外實驗部分主要是通過體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，研究富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞的抗凋亡的作用及其抗凋亡的機制。體內(nèi)實驗主要研究富血小板血漿處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞移植入皮膚缺損創(chuàng)面后，在體內(nèi)的存活及其對創(chuàng)面的再生愈合（表皮，真皮，血管等）促進作用。
　　 第一部分、（離體）富血小板血漿激活內(nèi)在機制對抗骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡
　　 目的：研究離

3、體氧化應(yīng)激狀態(tài)下，富血小板血漿對抗骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡，促進其存活的現(xiàn)象，同時探討其內(nèi)在的機制。
　　 方法：
　　 體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激條件——血清饑餓后雙氧水處理骨髓間充質(zhì)干細胞，MTT毒性檢測誘導(dǎo)的最佳條件及富血小板血漿的最佳濃度;在最佳誘導(dǎo)條件下，進一步研究富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)的抗凋亡作用，主要采取凋亡檢測、TUNEL染色方法驗證細胞凋亡和凋亡率及TYPAN blue染色法排除細胞存活及存活率;同時研究凋亡蛋白B

4、cl-xl及p-Bad的表達情況。為深入探討其抗凋亡機制，采用免疫細胞化學(xué)及ELASA實驗證明富血小板血漿是否具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞旁分泌的作用---主要研究生長因子VEGF和PDGF;同時檢測到富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞表面受體PDGFR的表達的影響;采用RT-PCR，Western blot，免疫細胞化學(xué)深入研究了富血小板血漿是否激活了骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)的信號通路PI3K-AKT-NFκB或JAK/STAT3;通過反證法，阻斷

5、PDGFR、PI3K、AKT，(LY294002，AG1295，SC66)研究富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞的一系列的作用:包括抗凋亡，促進旁分泌等作用是否改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、10um/ml的H2O2是體外最佳誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的條件;10％PRP及20％PRP是促進增殖的最佳濃度;
　　 2、通過MTT，APOPTOSIS，TUNEL，TYPAN BLUE等檢測證明了PRP的有效抗凋亡的作用，以10％或者

6、20％的濃度為最佳;
　　 3、檢測細胞內(nèi)的凋亡蛋白，PRP預(yù)處理后的MSC其Bcl-xl表達增高同時p-Bad表達降低，進一步證明PRP的抗凋亡作用;
　　 4、深入研究PRP發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)MSC的旁分泌的作用(—)VEGF及PDGF的表達都增高;并同時檢測MSC的表面受體PDGF的表達相應(yīng)增高;
　　 5、PRP預(yù)處理激活了信號通路PI3K-AKT-NFκB;6、阻斷整個信號通路，PRP的抗凋亡，促進分泌作用都明

7、顯降低甚至逆反。
　　 結(jié)論：10％PRP預(yù)處理促進MSC在體外氧化應(yīng)激條件下（10um/mlH2O2+血清剝奪）抗凋亡的作用，這種抵抗凋亡作用的機制源于激活MSC內(nèi)在信號通路PI3K-AKT-NFκB，同時促進MSC分泌VEGF及PDGF的作用。
　　 第二部分、研究體內(nèi)移植富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)存活情況及其再生修復(fù)作用
　　 目的：研究富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)存活及對急性

8、全層皮膚創(chuàng)面缺損的修復(fù)及再生能力。
　　 方法：
　　 1.動物模型的建立及分組:SD雄性大鼠24只，8周齡。隨機分為三組。頭一天晚上各組動物禁食，晨起，備皮。甲苯噻嗪（20mg/kg）及克他命（100mg/kg）麻醉。半小時后，手術(shù)剪在大鼠背部中央剪去約2.0×2.0cm大小的皮膚組織，制作皮膚全層缺損模型。本實驗動物分組如下，第一組:實驗組，皮下移植富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞;第二組:實驗對照組，移植骨髓

9、間充質(zhì)干細胞，（無富血小板血漿處理）;第三組:空白對照組，生理鹽水處理。各組細胞或鹽水量均為200ul.細胞濃度為5×106/ml。移植的骨髓間充質(zhì)干細胞為大鼠來源的GFP陽性MSC。
　　 2.體內(nèi)移植后檢測細胞的存活率及GFP陽性細胞檢測:分別于創(chuàng)面愈合的第1，3，5，7，12，22天取下全層皮膚包括皮下筋膜及肌肉，制作標(biāo)本。一半用于GFP陽性細胞檢測。同時運用活體動物成像儀檢測創(chuàng)面熒光信號強度。另一半，用于TUNEL染色，

10、檢測骨髓間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)凋亡情況。
　　 3.創(chuàng)面愈合情況的檢測及顯微鏡下組織的愈合狀況:創(chuàng)面愈合情況每隔3天觀察一次，并用數(shù)碼相機拍照，計算機處理圖像信息，運用面積計算法計算每次觀察愈合率的情況，創(chuàng)面愈合率=（初始面積一觀察面積）/初始面積×100％。微觀組織愈合率的評估采用馬松染色法，然后在顯微鏡下觀察其創(chuàng)面愈合情況（表皮、真皮愈合）。
　　 4.檢測表皮再生情況及創(chuàng)面生長因子檢測:取第7天及22天的皮膚樣品，制作

11、冰凍切片。lOμm厚度。冰甲醇固定1小時后，0.1％triton X-1OO打孔30分鐘。然后一抗孵育組織切片1小時:（小鼠抗大鼠a-SMA，VEGF兔抗大鼠CK5，PDGF);熒光標(biāo)記二抗(Alexa Fluor488-conjugated donkey anti-mouse andFITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG)孵育1-2小時。最后DAPI(Sigma Aldrich)復(fù)染后，熒光顯微鏡

12、下觀察。隨機選取10個中間區(qū)域進行鏡下評估。
　　 5.機制探討:免疫組織化學(xué)染色，檢測各組切片信號通路蛋白的表達情況。同樣取7天及22天的組織，4μm厚度標(biāo)本制作后，福爾馬林固定，石蠟包埋，梯度脫水后，烘干?？乖迯?fù)半小時，3％雙氧水處理切片，PBS反復(fù)漂洗4-5次后，一抗孵育:rabbit anti-rat p-AKT1，p-PI3K，NF-κB(1:100; EPITOMICS，Abcam)，4度，過夜。第二天，運用辣根過

13、氧化物酶標(biāo)記的二抗:horseradishperoxidase-coupled goat anti-rabbit IgG(1:1000; Santa Cruz)孵育1-2小時。 PBS洗4-5次，最后蘇木精復(fù)染。樹膠封片。顯微鏡下觀察。對比各組蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)的存活率較單獨移植的干細胞的存活率明顯升高，凋亡率相應(yīng)降低。
　　 2.富血小板血漿組跟

14、其余兩組對比，創(chuàng)面愈合率明顯升高，組織愈合時間明顯縮短;在細胞移植后第16天，創(chuàng)面幾乎完全愈合。而其余兩組動物創(chuàng)面的愈合率在每個檢測點均與富血小板組相比明顯低下，并且愈合時間偏長。微觀組織愈合狀況:富血小板血漿組，表皮再生情況明顯較其余兩組好，真皮膠原纖維排列規(guī)整，膠原粗大。
　　 3.富血小板血漿組明顯促進創(chuàng)面表皮再生:增強血管再生及密度，（免疫熒光顯示a-SMA及CK5的表達明顯比其余兩組高）;并且創(chuàng)面生長因子濃度VEGF，

15、PDGF也明顯比其余兩組高。
　　 4.信號蛋白的檢測:富血小板血漿組信號通路蛋白的表達比其余兩組高。這跟體外實驗結(jié)果相互呼應(yīng)。證明了體外實驗的假設(shè)即:富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞具有更強的生命力和再生能力，并且這種抗凋亡及再生的功能與其細胞內(nèi)的PI3K-AKT-NF-KB信號通路被激活密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 富血小板血漿預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞移植入全層缺損的大鼠創(chuàng)面后，具有較好的存活率，能