心肌營養(yǎng)素1促進人臍血間充質干細胞神經(jīng)分化及MAPK-ERK和PI3K-Akt信號通路的交互作用.pdf

1、目的：探討心肌營養(yǎng)素1( cardiotrophin1, CT1)對人臍血間充質干細胞（humanumbilical cord blood-derived MSCs, hUCB-MSCs)誘導神經(jīng)分化的促進作用及MAPK/ERK和PI3K/Ak信號通路在此過程中是否存在交互作用。
　　方法：(1)hUCB-MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:采集人臍血標本，采用改良密度梯度離心法及貼壁篩選法分離培養(yǎng)及純化hUCB-MSCs，采用流式細胞術鑒

2、定間充質干細胞表面標記；（2）腺病毒轉染：用Adv-CT1及Adv-EGFP以感染復數(shù)（MOI）=100PFU/cell分別轉染 hUCB-MSCs；（3）神經(jīng)誘導分化：采用神經(jīng)誘導劑（全反式維甲酸、谷氨酰胺及無血清高糖培養(yǎng)基）誘導hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化，于誘導后6h及4d觀察各組形態(tài)學變化，共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)元特異性核蛋白（NeuN）及膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達情況；(4)選用不同siRNA濃度(25nM、50nM、

3、100nM)摸索最佳轉染效率；（5）用siRNA-ERK及siRNA-Akt以最佳轉染效率的siRNA濃度轉染神經(jīng)誘導分化后的hUCB-MSCs，用 Western blot技術檢測基因沉默后各組 ERK、p-ERK、Akt、p-Akt及凋亡相關蛋白（Bax、Bcl-2）表達情況。
　　結果：(1)分離出的單個核細胞經(jīng)原代培養(yǎng)10天左右可見大量破骨樣細胞及少量呈集落生長的梭形細胞生長，14天左右可傳P1代，經(jīng)培養(yǎng)3-4天細胞融合度

4、達80％-90%可再次傳代，至P3代時細胞形態(tài)均一，流式細胞術免疫表型檢測結果顯示，高表達間充質干細胞表面標志 CD44、CD90、CD73、CD105，不表達造血干細胞表面標志CD34及單核細胞表面標志CD45。（2）腺病毒以最佳感染復數(shù)轉染72小時后，CT1能在hUCB-MSCs中穩(wěn)定表達；（3）神經(jīng)誘導分化6h后，除空白對照組外，其余各組均出現(xiàn)類神經(jīng)細胞形態(tài)變化（胞質向胞核皺縮，并伸出長的突起），CT1組變化更顯著，且CT1組較其

5、余各組相比NeuN表達量最高（44.23±2.83%），差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05），隨著誘導時間延長，細胞形態(tài)變化更明顯，交織呈網(wǎng)狀，NeuN表達量也逐漸增加，誘導4d后CT1組表達量最高（82.50±4.17%），差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；誘導6h后，GFAP即有表達，CT1組表達量最高（（55.37±3.31%）），差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；隨后逐漸增加，誘導4d后CT1組表達量最高（82.04±3.23%），

6、差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；（4）經(jīng)siRNA轉染72h后，濃度為100nM組轉染效率最高（91.67±1.74%），差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；（5）siRNA-ERK組及siRNA-Akt組的p-EKR、p-Akt、Bcl-2表達水平較CT1組及siRNA-control組明顯減低，而Bax相對增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　結論：（1）密度梯度離心結合直接貼壁可高效分離提取 hUCB-MSCs；（2