腺病毒介導(dǎo)的心肌營養(yǎng)素-1對人臍血間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化作用及ERK分子機制研究.pdf

1、目的:(1)探討CT-1(Cardiotrophin1)是否對hUCB-MSCs神經(jīng)分化具有促進作用,尋找一種合適的細胞因子誘導(dǎo)hUCB-MSCs分化為神經(jīng)樣細胞,可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病修復(fù)帶來希望;(2)研究MAPK/ERK信號分子在hUCB-MSCs神經(jīng)分化中的調(diào)控機制。
　　方法:(1)分離、培養(yǎng)及鑒定hUCB-MSCs:收集人臍帶血標本,用改良密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離臍血中單個核細胞,觀察細胞形態(tài)變化并繪制生長曲線,用流式

2、細胞術(shù)鑒定細胞表面標志物CD34、CD29、CD44和CD105的表達。(2)病毒轉(zhuǎn)染:將Adv-CT-1及Adv-EGFP(腺病毒增強型綠色熒光蛋白)分別轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs,于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h用免疫熒光染色檢測CT-1表達率,熒光顯微鏡下觀察CT-1和 EGFP轉(zhuǎn)染成功率。(3)神經(jīng)標志物及凋亡相關(guān)蛋白檢測:免疫熒光分別檢測對照組、EGFP組、CT-1組及NIM組Nestin、NeuN及MBP神經(jīng)標志物表達;W

3、estern Blot方法檢測轉(zhuǎn)染CT-1組及對照組調(diào)亡相關(guān)蛋白bcl2、Bax、Bak等表達情況。(4)免疫共沉淀法(CO-IP)及Western Blot法檢測不同時間點hUCB-MSCs的CT-1受體(gp130和LIFRβ)及信號分子p-Raf-1、ERK1/2和p-ERK1/2表達;加入MEK抑制劑后Western Blot法檢測Nestin、NeuN、MBP及p-ERK表達情況。
　　結(jié)果:(1)hUCB-MSCs培養(yǎng)

4、及鑒定:原代細胞培養(yǎng)第5d可見多角形細胞和大量大而圓的破骨樣細胞及雜細胞,12 d后可見大量梭形細胞呈集落樣生長,平均28 d可以傳代。傳代后約12 h后細胞逐漸貼壁,細胞呈均一的梭形細胞,3-5 d可再次傳代, P3細胞得到形態(tài)均一,3-4d細胞融合率達90％。分離培養(yǎng)出hUCB-MSCs高表達間充質(zhì)相關(guān)抗原CD105(89.31%)、整合素家族CD29(98.41%)、細胞黏附分子CD44(99.20%)、不表達造血干細胞標志 CD

5、34。(2)腺病毒轉(zhuǎn)染:病毒轉(zhuǎn)染率隨著時間及 MOI的改變而變化,病毒 MOI為100PFU/細胞時,在轉(zhuǎn)染72h,轉(zhuǎn)染效率較高(87.60±1.36%)且細胞形態(tài)與生長方式與未感染細胞相同,為最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。(3) CT-1對hUCB-MSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化作用:誘導(dǎo)6h后CT-1組及NIM組即呈類神經(jīng)細胞樣形態(tài)改變,CT-1組變化更明顯;4組中,CT-1組Nestin陽性率最高(86.82±4.29%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

6、;至第4d時,各組Nestin表達明顯減少,CT-1組仍高于其他組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);誘導(dǎo)后6 h,CT-1組NeuN即有少量表達(14.26±2.20%),隨后逐漸升高,第4d時陽性率達48.33±2.53%;CT-1組陽性率均高于其他各組(P<0.05);誘導(dǎo)后6h,各組MBP均有少量表達,隨后表達率逐漸升高,至第4d時陽性率最高,CT-1組6h(14.12±2.16%)及4d(45.63±2.78%)時MBP陽性率

7、均高于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);CT-1對 bax、bak及caspase3等凋亡相關(guān)蛋白影響:Western Blot結(jié)果顯示CT-1組bcl-2表達較對照組增加,CT-1組凋亡相關(guān)蛋白bax、bak、caspase3及caspase9表達(0.01±0.00,0.09±0.01,0.30±0.01,0.32±0.02)低于對照組(0.16±0.01,1.14±0.02,0.58±0.01,0.72±0.01),差異

8、有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(4)不同時間點CT-1受體(gp130和LIFRβ)表達及ERK1/2、Raf-1磷酸化表達:轉(zhuǎn)染后24小時,hUCB-MSCs可見p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130微弱表達,未見LiFRβ表達;48h見LiFRβ微弱表達,p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130表達增強,與24h相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);72h時,gp130/ LiFRβ及ERK1/2表達未見進一步增強;p-ERK

9、1/2和p-Raf-1表達仍繼續(xù)增加,與48h相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。加入不同濃度PD98059后ERK磷酸化、MBP、NeuN及Nestin水平變化:10 umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達減少(P<0.05);100 umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達明顯減少,與10 umol//L組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。