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1、以恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis AS1.0562)為乳酸氧化酶(Lactate Oxidase,LOD)制備的菌種來源,對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件、乳酸氧化酶提取工藝、酶學(xué)性質(zhì)及其固定化催化DL-乳酸生產(chǎn)丙酮酸進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 培養(yǎng)基中添加甘油3.0﹪,蛋白胨0.4﹪,DL-乳酸1.0﹪,維生素B<,1> 0.005﹪,KH<,2>PO<,4>·H<,2>O 0.05﹪,MgSO<
2、,4>·7H<,2>O 0.05﹪,硫酸亞鐵胺0.01﹪有助于產(chǎn)酶;優(yōu)化發(fā)酵條件為:250mL三角瓶中裝液量50mL,起始pH7.2,培養(yǎng)溫度37℃,靜置培養(yǎng)4d,乳酸氧化酶平均酶活為65.4U/mL。 采用均勻設(shè)計法優(yōu)化了乳酸氧化酶提取工藝,超聲波法的最佳工藝條件為:超聲功率100W,超聲時間8min,磷酸鹽緩沖液pH 7.8;凍融法的最佳工藝條件為:凍融次數(shù)4次,解凍時間25min,解凍溫度37℃,磷酸鹽緩沖液。pH7.4;
3、在優(yōu)化工藝條件下,超聲波法提取效果要優(yōu)于凍融法。 恥垢分枝桿菌經(jīng)增菌誘導(dǎo)培養(yǎng)、超聲波破碎、高速冷凍離心后獲得乳酸氧化酶粗酶液,經(jīng)30﹪~70﹪飽和度的硫酸銨分級沉淀及透析脫鹽初步純化后,對其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究,該酶的最適反應(yīng)溫度為37℃,反應(yīng)溫度高于65℃時酶蛋白基本上完全變性失活,55℃保溫60min酶活保存40﹪;最適反應(yīng)pH為7.4,在pH6.5~8.0范圍內(nèi)酶蛋白穩(wěn)定;低濃度的Na<'+>和Mn<'2+>、CO<'2+>
4、對該酶有激活作用, Ca<'2+>、Mg<'2+>、Zn<'2+>、Al<'3+>、Fe<'3+>、Cd<'2+>對該酶有抑制作用;表面活性劑十二烷基磺酸鈉、吐溫20、吐溫60能增強(qiáng)酶蛋白的熱穩(wěn)定性;酶的動力學(xué)分析表明:以DL-乳酸為底物的Km=9.24×10<'-3>mol/L,Vmax=2.42μmol/(min·mg)。 采用海藻酸鈉包埋、戊二醛交聯(lián)方法固定化乳酸氧化酶,優(yōu)化了固定化酶的制備條件,測試了部分酶學(xué)性質(zhì)。1mL
5、酶液和1mL4﹪的海藻酸鈉溶液混合后,用注射器滴入到20mL 0.2mol/L的CaCl<,2>溶液中,25℃靜置固化2h后,過濾洗滌,轉(zhuǎn)移到0.2﹪戊二醛溶液中25℃交聯(lián)2h,再經(jīng)過濾、洗滌和干燥得到球狀固定化酶。經(jīng)固定化后的酶,熱穩(wěn)定性得到顯著提高,游離酶在65℃保溫1h酶蛋白完全變性失活,而固定化酶在65℃保溫1h仍可保持86﹪的酶活力;其最適酶促反應(yīng)溫度由37℃升至55℃,最適反應(yīng)pH=7.4保持不變;在不加保護(hù)劑的條件下,4℃
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