乳酸氧化酶的制備及其固定化催化DL-乳酸生產丙酮酸研究.pdf

1、以恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis AS1.0562)為乳酸氧化酶(Lactate Oxidase，LOD)制備的菌種來源，對其產酶發(fā)酵條件、乳酸氧化酶提取工藝、酶學性質及其固定化催化DL-乳酸生產丙酮酸進行了系統(tǒng)的研究。主要研究內容和結果如下： 培養(yǎng)基中添加甘油3.0﹪，蛋白胨0.4﹪，DL-乳酸1.0﹪，維生素B<,1> 0.005﹪，KH<,2>PO<,4>·H<,2>O 0.05﹪，MgSO<

2、,4>·7H<,2>O 0.05﹪，硫酸亞鐵胺0.01﹪有助于產酶；優(yōu)化發(fā)酵條件為：250mL三角瓶中裝液量50mL，起始pH7.2，培養(yǎng)溫度37℃，靜置培養(yǎng)4d，乳酸氧化酶平均酶活為65.4U/mL。 采用均勻設計法優(yōu)化了乳酸氧化酶提取工藝，超聲波法的最佳工藝條件為：超聲功率100W，超聲時間8min，磷酸鹽緩沖液pH 7.8；凍融法的最佳工藝條件為：凍融次數(shù)4次，解凍時間25min，解凍溫度37℃，磷酸鹽緩沖液。pH7.4；

3、在優(yōu)化工藝條件下，超聲波法提取效果要優(yōu)于凍融法。 恥垢分枝桿菌經增菌誘導培養(yǎng)、超聲波破碎、高速冷凍離心后獲得乳酸氧化酶粗酶液，經30﹪～70﹪飽和度的硫酸銨分級沉淀及透析脫鹽初步純化后，對其酶學特性進行了研究，該酶的最適反應溫度為37℃，反應溫度高于65℃時酶蛋白基本上完全變性失活，55℃保溫60min酶活保存40﹪；最適反應pH為7.4，在pH6．5～8.0范圍內酶蛋白穩(wěn)定；低濃度的Na<'+>和Mn<'2+>、CO<'2+>

4、對該酶有激活作用， Ca<'2+>、Mg<'2+>、Zn<'2+>、Al<'3+>、Fe<'3+>、Cd<'2+>對該酶有抑制作用；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、吐溫20、吐溫60能增強酶蛋白的熱穩(wěn)定性；酶的動力學分析表明：以DL-乳酸為底物的Km=9.24×10<'-3>mol/L，Vmax=2.42μmol/(min·mg)。 采用海藻酸鈉包埋、戊二醛交聯(lián)方法固定化乳酸氧化酶，優(yōu)化了固定化酶的制備條件，測試了部分酶學性質。1mL

5、酶液和1mL4﹪的海藻酸鈉溶液混合后，用注射器滴入到20mL 0.2mol/L的CaCl<,2>溶液中，25℃靜置固化2h后，過濾洗滌，轉移到0.2﹪戊二醛溶液中25℃交聯(lián)2h，再經過濾、洗滌和干燥得到球狀固定化酶。經固定化后的酶，熱穩(wěn)定性得到顯著提高，游離酶在65℃保溫1h酶蛋白完全變性失活，而固定化酶在65℃保溫1h仍可保持86﹪的酶活力；其最適酶促反應溫度由37℃升至55℃，最適反應pH=7.4保持不變；在不加保護劑的條件下，4℃