Cf介導(dǎo)的ETI和針對稻白葉枯病菌的非寄主抗性的分子調(diào)控機理.pdf

1、根據(jù)所涉植物是否為所涉病原物的寄主，植物的抗病性可分為寄主抗性和非寄主抗性(nonhost resistance)。兩類抗病性的產(chǎn)生機理既有許多共同點也有一些明顯的區(qū)別。寄主抗性有病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫(PAMP triggered immunity，PTI)和病原物效應(yīng)蛋白觸發(fā)的免疫(Effector triggered immunity, ETI)兩個層次。番茄與葉霉菌(Cladosporium fulvum)的互作為典型的基因

2、對基因(gene-for-gene)寄主抗性，番茄抗葉霉菌基因Cf介導(dǎo)產(chǎn)生對攜帶互補Avr基因的葉霉菌的ETI抗性。水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)寄主范圍窄，在非寄主本氏煙(Nicotianabenthamiana)中誘導(dǎo)產(chǎn)生強烈的過敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)和非寄主抗性。本論文主要針對兩個問題開展研究，首先，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，介導(dǎo)產(chǎn)生ETI的植物抗病

3、(resistance，R)基因不存在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。本論文通過對Cf介導(dǎo)的ETI研究發(fā)現(xiàn)，番茄Cf基因存在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控;另外，本氏煙中Xoo誘導(dǎo)的HR和非寄主抗性產(chǎn)生機理尚不明確。本研究采用多種策略篩選鑒定該非寄主抗性調(diào)控基因，并明確了農(nóng)桿菌對該非寄主抗性的抑制作用及機制。本研究獲得了以下主要結(jié)果:
　　1.初步明確了番茄抗葉霉病基因Cf-4和Cf-9基因表達(dá)調(diào)控機理。分別從轉(zhuǎn)錄水平—DNA甲基化以及轉(zhuǎn)

4、錄后水平—miRNA兩個層次，對Cf-4和Cf-9基因表達(dá)調(diào)控機理進(jìn)行了分析。在轉(zhuǎn)錄水平上，高溫抑制Cf基因的表達(dá)，Avr強烈誘導(dǎo)Cf基因的表達(dá)，Cf-4的表達(dá)隨著番茄植株株齡增加而升高，而Cf-9不受顯著影響。啟動子DNA甲基化參與高溫抑制的以及常溫下Avr9誘導(dǎo)的Cf-9基因的表達(dá)調(diào)控，另外在由高溫到常溫的降溫過程中Avr4和Avr9對Cf-4和Cf-9基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用可能受到甲基化的調(diào)控。采用VIGS技術(shù)，分析了番茄甲基化酶以及

5、去甲基化酶基因?qū)f基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)番茄個別甲基化酶和全部4個去甲基化酶基因單獨沉默顯著改變Cf-4和Cf-9基因的表達(dá)，說明這些番茄甲基化酶和去甲基化酶基因可能參與對Cf表達(dá)的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄后水平，我們預(yù)測到了一條能夠同時靶標(biāo)Cf-4和Cf-9基因的長度為21nt的miRNA。通過該miRNA的靶標(biāo)序列與前體序列共表達(dá)等分析，證實該miRNA能有效降解Cf-4和Cf-9 mRNA。
　　2.篩選獲得一批Cf-4/Avr4介導(dǎo)的

6、HR的調(diào)控基因。通過差異表達(dá)蛋白對應(yīng)基因的功能分析及本氏煙cDNA文庫VIGS篩選，我們從500多個基因沉默結(jié)構(gòu)中，篩選得到了28個參與調(diào)控Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR的基因，其中核糖核蛋白RNP、一個DNA結(jié)合蛋白和一個Dof鋅指蛋白等正調(diào)控Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR，而一個環(huán)指蛋白、一個含BTB/POZ和TAZ結(jié)構(gòu)域蛋白、CP結(jié)合蛋白、SUMO結(jié)合酶SCE1、紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶RCCR等22個蛋白負(fù)調(diào)控Cf-4/Avr4介導(dǎo)

7、的HR。
　　3.建立和優(yōu)化了本氏煙—Xoo非寄主抗性互作體系并研究明確H2O2積累是Xoo誘導(dǎo)的HR和非寄主抗性產(chǎn)生所必需。研究結(jié)果表明，用1×108 cfu/ml的Xoo接種本氏煙完全展開的葉片，28℃下培養(yǎng)將產(chǎn)生最迅速最強烈的非寄主抗性。Xoo接種先在浸潤區(qū)域內(nèi)誘導(dǎo)活性氧大量積累，而后導(dǎo)致產(chǎn)生強烈的HR，并強烈誘導(dǎo)PR和HR標(biāo)志基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致Xoo的菌量急劇下降。采用過氧化氫酶清除H2O2的藥理學(xué)實驗結(jié)果表明，H2O2

8、在Xoo誘導(dǎo)的HR和非寄主抗性中至關(guān)重要。
　　4.篩選獲得一批Xoo誘導(dǎo)的本氏煙非寄主抗性調(diào)控基因。通過差異表達(dá)蛋白對應(yīng)基因功能分析及本氏煙cDNA文庫VIGS篩選，我們從500多個基因沉默結(jié)構(gòu)中篩選獲得了8個調(diào)控Xoo誘導(dǎo)的本氏煙HR的基因，其中碳酸酐酶、硫氧還蛋白hl以及核糖核蛋白是該HR的負(fù)調(diào)控因子，而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、尿嘧啶特異的內(nèi)切酶DnaJ同源亞家族基因成員、GTP結(jié)合蛋白以及三生煙中的硫氧還蛋白h這五個基因則

9、為正調(diào)控因子。本氏煙核糖核蛋白基因同時參與Xoo誘導(dǎo)的HR和Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR的調(diào)控，但作用相反。
　　5.闡明了農(nóng)桿菌對Xoo的抑菌作用以及對Xoo誘導(dǎo)的HR的抑制作用及其機制。結(jié)果顯示，四種農(nóng)桿菌菌株對Xoo誘導(dǎo)的HR的抑制作用有顯著差異，菌株GV3101，EHA105和LBA4404能強烈抑制，但菌株C58C1無此作用。三種農(nóng)桿菌對Xoo誘導(dǎo)的HR的抑制作用機制不同，菌株GV3101通過直接抑制Xoo的生長來抑制H

10、R，該抑制作用需要Xoo中三型分泌系統(tǒng)基因hrcU和農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTiC58的參與。菌株LBA4404和EHA105則無直接抑菌作用，而是通過抑制本氏煙上活性氧的積累來抑制HR的產(chǎn)生。
　　綜上所述，本研究首次揭示了f-4和f-9基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用及其機理，鑒定了首個調(diào)節(jié)Cf基因表達(dá)的miRNA。此外，利用cDNA文庫VIGS篩選技術(shù)，從500多個基因沉默結(jié)構(gòu)中篩選獲得一批參與Xoo誘導(dǎo)的本氏煙HR和Cf-4/