桂花香氣基因GES和ADH的cDNA克隆和紅檵木轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、桂花是我國主要觀賞樹種之一，花香濃郁。紅檵木則是近年來我國南方廣泛栽種的觀賞樹種，生態(tài)適應(yīng)性強，花朵顏色紅艷，但幾乎沒有花香?；诖?，本研究以四季桂為材料，采用同源克隆及RACE技術(shù)，對香氣合成關(guān)鍵基因GES和ADH進行cDNA全長克隆，并進行生物信息學(xué)分析，通過半定量RT-PCR技術(shù)分析GES和ADH基因在不同季節(jié)、組織、花期的差異表達規(guī)律;同時開展紅檵木的高效再生體系建立研究，在此基礎(chǔ)上建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果如下:

2、r>　　1、四季桂GES和ADH基因的全長cDNA序列獲得。以四季桂花瓣為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，通過RT-PCR獲得保守性片段序列，以此cDNA序列為基礎(chǔ)，先后進行3'RACE、5'RACE和全長克隆，獲得四季桂GES和ADH基因的全長cDNA序列。
　　2、四季桂GES和ADH基因的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，GES基因的cDNA序列長1900bp，ORF長1745bp，編碼583個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分

3、子質(zhì)量為146839.3Da，等電點為4.92。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示GES蛋白沒有跨膜區(qū)螺旋，α-螺旋區(qū)域較多，β-螺旋區(qū)域較少，親水脂性螺旋區(qū)域較多。ADH基因cDNA序列長1223bp，ORF長1005bp，編碼334個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為36105.99Da，等電點為5.76，沒有跨膜區(qū)螺旋，α-螺旋區(qū)域少，β-螺旋區(qū)域相對較多，有部分親水脂性的螺旋區(qū)域。
　　3、四季桂GES和ADH基因的表達規(guī)律研究。以四季桂3、

4、6、9、12月份不同花期的花瓣和葉片為材料，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，進行GES和ADH基因的半定量RT-PCR，差異表達結(jié)果表明，GES和ADH基因在花瓣當中的表達量明顯高于在葉片中的表達量，且盛花期的表達量高最高。初步推測GES和ADH基因的表達對四季桂花瓣香氣物質(zhì)的產(chǎn)生有重要影響。
　　4、紅檵木高效再生體系建立研究。以紅檵木莖尖為材料，通過優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)與增殖，不定芽誘導(dǎo)、增殖與生根的培養(yǎng)基與激素配比

5、，進行紅檵木高效再生體系研究。結(jié)果表明，紅檵木外植體最佳消毒方案為兩次升汞消毒法:0.1％HgCl2兩次消毒，各3分鐘;最佳愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的培養(yǎng)基配方分別為:MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.7 mg/L、MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.06 mg/L;首次使用AgNO3，獲得最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方:MS+6-BA1.5 mg/L+ NAA0.01mg/L+ AgNO31 mg/L;不定芽增殖最佳培養(yǎng)基配方為:M

6、S+6-BA1.0 mg/L+IBA0.05 mg/L+Vc5.0 mg/L;最佳不定芽生根方案為:選擇2.1-3.0 cm的不定芽，保留2-4葉片，接種至1/2 MS+IBA4.5 mg/L培養(yǎng)基。
　　5、四季桂ADH基因轉(zhuǎn)化紅檵木的研究。在四季桂ADH基因克隆和紅檵木高效再生體系的基礎(chǔ)上，以四季桂ADH基因的全長cDNA為模板，通過PCR擴增、雙酶切將ADH基因插入至pCAMBIA2301載體中，成功構(gòu)建了ADH基因的植物過