AdvmICOSIg阻斷ICOS共刺激通路對(duì)MLD-STZ誘導(dǎo)的T1D的治療作用.pdf

1、一、研究背景和目的 1型糖尿病(Type1Diabetes，T1D)是由自身免疫紊亂引起的糖尿病，其發(fā)病過(guò)程表現(xiàn)為兩個(gè)階段：首先是多種因素引起炎癥因子的分泌，導(dǎo)致局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，引起胰腺炎；隨后發(fā)展為自身耐受被打破，活化后的CD4+T和CD8+T細(xì)胞攻擊自身β細(xì)胞，引起β細(xì)胞大部分死亡，導(dǎo)致胰島素分泌不足，血糖濃度過(guò)高而引起糖尿病。T細(xì)胞對(duì)β細(xì)胞的特異性殺傷是T1D發(fā)生的直接原因。 T細(xì)胞活化機(jī)制方面的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的

2、有效活化和效應(yīng)發(fā)揮需要共刺激信號(hào)，缺乏共刺激信號(hào)的抗原刺激引起免疫耐受。針對(duì)已知的幾種共刺激分子(CD28、CD40L、CTLA-4等)的研究數(shù)據(jù)表明，缺乏共刺激分子或用適當(dāng)?shù)氖侄巫钄喙泊碳ば盘?hào)途徑，T細(xì)胞不能有效的活化和增殖。鑒于共刺激分子對(duì)免疫應(yīng)答中的重要影響，其在自身免疫性糖尿病中的作用吸引了研究者的興趣。其中Arreaza,G.A等和Balasa,B等分別用CD28和CD40L阻斷性單抗治療NOD小鼠自發(fā)產(chǎn)生的糖尿病，發(fā)現(xiàn)這些試

3、劑對(duì)防止2-4周大的NOD小鼠發(fā)生胰腺炎和IDDM糖尿病有效，但對(duì)5-7周大的小鼠無(wú)效。這些結(jié)果提示當(dāng)T1D表現(xiàn)出臨床癥狀時(shí)，CD28、CD40L等提供的共刺激信號(hào)并不重要，在維持著T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)上，存在其他的共刺激途徑。 近年來(lái)，有關(guān)T細(xì)胞活化共刺激信號(hào)的研究取得了許多新進(jìn)展。明確了B7-1/B7-2一CD28/CTLA-4和CD40L-CD40共刺激信號(hào)通路在激發(fā)初始T細(xì)胞活化中的主導(dǎo)地位，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，大部分效應(yīng)性CD8+

4、和CD4+T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持，以及記憶性T細(xì)胞發(fā)生再次應(yīng)答不依賴(lài)這兩條共刺激信號(hào)通路，體內(nèi)還存在其它共刺激信號(hào)通路。這些共刺激信號(hào)在T細(xì)胞應(yīng)答的不同時(shí)空階段，對(duì)T細(xì)胞的功能和效應(yīng)發(fā)揮著各自不同的調(diào)節(jié)作用。聯(lián)系到T1D發(fā)病時(shí)的特點(diǎn)，此時(shí)體內(nèi)已經(jīng)存在大量活化后的T細(xì)胞，干預(yù)上述共刺激途徑的局限性可能在于上述這些共刺激途徑只在初始T細(xì)胞的活化階段上發(fā)揮重要作用，而在記憶和效應(yīng)T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持階段上可能存在其他的途徑。最近，ICOS-

5、B7h信號(hào)通路在調(diào)節(jié)記憶性和效應(yīng)性T細(xì)胞功能、維持外周耐受方面的重要意義引起我們極大的關(guān)注。 ICOS(InducibleCOStimulate，誘導(dǎo)共刺激分子)是CD28家族的第3個(gè)成員，僅誘導(dǎo)性表達(dá)于活化的T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞。其配體ICOSL(B7h，B7RP-1)是B7家族成員，主要表達(dá)于B細(xì)胞和單核細(xì)胞?，F(xiàn)在認(rèn)為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持依賴(lài)于ICOS的共刺激信號(hào)。ICOS的功能特點(diǎn)提示其在T細(xì)胞對(duì)β細(xì)胞的

6、殺傷過(guò)程中起重要作用，調(diào)節(jié)ICOS途徑可能可以調(diào)控T細(xì)胞對(duì)β細(xì)胞的殺傷。 基于以上分析，本研究擬首先建立MLD-STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠的動(dòng)物模型，觀察ICOS-B7h信號(hào)通路在1型糖尿病模型小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況；然后構(gòu)建制備純化重組腺病毒AdvmICOSIg，觀察其對(duì)胰島細(xì)胞系NIT-1的感染能力，驗(yàn)證mICOSIg的正確表達(dá)分泌，并用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)研究mICOSIg對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響；在此基礎(chǔ)上，尾靜脈注射重組AdvmI

7、COSIg腺病毒，觀察AdvmICOSIg對(duì)MLD-STZ誘導(dǎo)的T1D病情的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 二、方法和結(jié)果 1.T1D動(dòng)物模型的誘導(dǎo)和ICOS-B7h在T1D小鼠胰腺中的表達(dá)和意義：以40mg/kgSTZ對(duì)C57BL/6雄性小鼠進(jìn)行連續(xù)5天的腹腔注射，采集血液測(cè)量血糖水平，以連續(xù)兩次血糖濃度高于12mmol/L為糖尿病小鼠，連續(xù)5周跟蹤檢測(cè)小鼠的血糖濃度及體重變化；檢測(cè)結(jié)果表明小鼠血糖濃度顯著增高

8、而體重明顯下降，且體征持續(xù)一個(gè)月，與文獻(xiàn)報(bào)道的STZ糖尿病小鼠模型一致。表明STZ在小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)I型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。用RT-PCR、WB、IHC和FACS分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)ICOS和B7h的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病程的發(fā)展，ICOS和B7h的表達(dá)顯著增加。 2.mICOSIg腺病毒的構(gòu)建、制備和純化及其活性的體外研究：通過(guò)酶切連接的方式將mICOSIg的表達(dá)框連入pAdtrack-CMV穿梭載體，后者在Adeas

9、y-1大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，隨后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行病毒顆粒包裝。收集病毒后感染NIT-1細(xì)胞，用免疫印跡證實(shí)mICOSIg在NIT-1細(xì)胞中的正確分泌表達(dá)。大量擴(kuò)增病毒后，利用膜吸附技術(shù)純化病毒，通過(guò)EGFP報(bào)告基因確定病毒滴度為3.16X1010/ml。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，mICOSIg上清與對(duì)照比，能顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖。 3.尾靜脈注射AdvmICOSIg，研究其對(duì)MLD-STZ誘導(dǎo)的TID的病情影響：M

10、LD-STZ誘導(dǎo)T1D后兩周，尾靜脈分別注射1X1O9AdvmICOSIg病毒和Adtrack對(duì)照病毒，3天后重復(fù)一次。每周檢測(cè)一次血糖、體重，結(jié)果表明注射AdvmICOSIg后1周小鼠血糖濃度即開(kāi)始下降，到第21天最低，此后持續(xù)兩周均低于12mmol/1的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。五周后處死，HE染色表明AdvmICOSIg組胰腺的炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)減少。第二次病毒注射后3天處死部分小鼠，收集全部血液，離心取血清，ELISA檢測(cè)mICOSIg的含量。

11、結(jié)果發(fā)現(xiàn)3倍比稀釋4次后，注射AdvmICOSIg腺病毒的小鼠血清mICOS含量仍高于對(duì)照組，提示尾靜脈注射AdvmICOSIg腺病毒后，mICOSIg在小鼠體內(nèi)分泌表達(dá)。 4.AdvmICOSIg影響T1D的可能機(jī)制：a)AdvmICOSIg腺病毒作用后，小鼠胰腺淋巴結(jié)內(nèi)CD4+D25+T細(xì)胞比例增加：同前用小劑量STZ作用5天，誘導(dǎo)建立MLD-STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型后兩周，尾靜脈分別注射1X109AdvmICOSIg病毒

12、和Adtrack對(duì)照病毒，3天后重復(fù)一次。注射病毒后2周，取小鼠胰腺淋巴結(jié)，制備成單個(gè)細(xì)胞懸液后利用多色FACS檢測(cè)CD4+CD25+陽(yáng)性細(xì)胞比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AdvmICOSIg作用后，胰腺淋巴結(jié)中CD4+CD25+陽(yáng)性細(xì)胞比例增加。b)mICOSIg阻斷ICOS信號(hào)后減少了表達(dá)ICOS細(xì)胞的數(shù)量。利用FACS檢測(cè)AdmICOS處理后的小鼠PLN細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，AdvmICOSIg處理后，小鼠體內(nèi)ICOS+細(xì)胞顯著下降，說(shuō)明A

13、dvmICOSIg抑制了體內(nèi)ICOS陽(yáng)性細(xì)胞的產(chǎn)生。c)AdvmICOSIg腺病毒作用后，影響了小鼠胰腺淋巴結(jié)內(nèi)活化的T細(xì)胞的亞群分布。以胰腺淋巴結(jié)中ICOS陽(yáng)性細(xì)胞為研究對(duì)象，多色FACS分析結(jié)果表明與對(duì)照組相比，AdvmICOSIg作用后ICOS陽(yáng)性細(xì)胞中CD4陽(yáng)性細(xì)胞比例增加，而CD4陰性細(xì)胞比例顯著下降。表明AdvmICOSIg作用后減少了CD8+亞群數(shù)量，通過(guò)抑制活化后的CD8效應(yīng)性T細(xì)胞的殺傷作用來(lái)保護(hù)胰島細(xì)胞。d)體外細(xì)胞

14、試驗(yàn)表明，mICOSIg能促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡。體外細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞活化后，與對(duì)照相比，mICOSIg上清促進(jìn)凋亡的發(fā)生。說(shuō)明AdmICOS可能通過(guò)分泌的mICOSIg來(lái)促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，從而使體內(nèi)的ICOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少。 三、結(jié)論 1.在MLD-STZ誘導(dǎo)的T1D小鼠體內(nèi)，ICOS和B7h在胰腺淋巴結(jié)表達(dá)增加。而且B7h的表達(dá)可見(jiàn)于發(fā)病后的小鼠胰腺組織局部?jī)?nèi)。提示ICOS-B7h信號(hào)通路可能參與了MLD-STZ

15、誘導(dǎo)后的糖尿病發(fā)病過(guò)程。 2.制備純化了重組AdvmICOSIg腺病毒，發(fā)現(xiàn)其可以有效感染NIT-1胰島細(xì)胞系，并可使后者分泌mICOSIg。利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)證實(shí)分泌的mICOSIg能抑制淋巴細(xì)胞增殖。 3.MLD-STZ成功誘導(dǎo)小鼠發(fā)生T1D后，注射重組AdvmICOSIg腺病毒，可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)分泌mICOSIg，胰腺組織局部可見(jiàn)重組AdvmICOSIg腺病毒感染后的細(xì)胞。而與對(duì)照組相比，注射重組AdvmICO

16、SIg腺病毒后能緩解糖尿病病情。 4.重組AdvmICOSIg腺病毒對(duì)糖尿病小鼠的保護(hù)機(jī)制可能在于腺病毒轉(zhuǎn)基因體內(nèi)表達(dá)分泌mICOSIg后，后者阻斷了ICOS-B7h信號(hào)通路，通過(guò)以下幾個(gè)方面產(chǎn)生保護(hù)作用：1)提高CD4+CD25+T細(xì)胞的比例；2)使胰腺淋巴結(jié)中活化后的T細(xì)胞由于缺乏ICOSB7h信號(hào)而因凋亡而死去；3)降低了活化后的發(fā)揮殺傷效應(yīng)的CD8+T細(xì)胞的相對(duì)比例，而提高了ICOS+CD4+細(xì)胞的比例。 5.本