自噬在肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床預(yù)后相關(guān)性分析.pdf

1、肝內(nèi)膽管癌ICC(Intrahepatic cholangiocarcinoma)約占原位肝癌發(fā)生率的10％，近年來已經(jīng)上升為肝內(nèi)原發(fā)腫瘤導(dǎo)致死亡的第一位。目前認(rèn)為，肝內(nèi)膽管癌發(fā)生與膽管結(jié)石、HBV/HCV感染以及一些其他膽管炎癥等因素有關(guān)。ICC發(fā)病較隱匿，臨床癥狀不典型，較難早期診斷，大部分肝內(nèi)膽管癌發(fā)現(xiàn)時已是晚期，無法手術(shù)治療。即使早期發(fā)現(xiàn)手術(shù)治療的，其五年生存率＜15-20％。相對HCC而言， ICC同樣是多基因參與多步驟協(xié)同的

2、復(fù)雜病理過程，但對ICC發(fā)展過程的了解卻遠(yuǎn)沒有HCC深入，因此發(fā)現(xiàn)ICC中異常的分子和信號通路，有助于加深對ICC病理發(fā)展進(jìn)程的認(rèn)識，從而為肝內(nèi)膽管癌的預(yù)防、診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 自噬是生物體內(nèi)一種相對保守的對物質(zhì)進(jìn)行分解代謝的過程，它通過“自我清除”細(xì)胞內(nèi)無用的、累積的蛋白質(zhì)聚集物和有缺陷的細(xì)胞器等，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在受到饑餓、高溫、低氧等外界環(huán)境刺激下，細(xì)胞通過提高自噬水平，將胞漿內(nèi)多余組分分解為游離氨基酸、

3、脂肪酸和核苷酸，維持細(xì)胞的能量代謝。一些研究表明，自噬能夠抑制腫瘤的生長，發(fā)揮抑癌基因的作用，自噬相關(guān)調(diào)控基因Beclinl的失活可以促進(jìn)裸鼠體外腫瘤的生長，過表達(dá)beclinl或atg5能抑制裸鼠乳腺癌模型腫瘤的生長。另一些研究則表明，自噬表達(dá)水平的提高能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在腫瘤內(nèi)環(huán)境各種應(yīng)激條件下存活和生長。有報道在營養(yǎng)剝奪狀態(tài)下，即使凋亡被抑制，應(yīng)用抑制劑間接抑制自噬或是直接使自噬相關(guān)基因Beclinl或Atg5等失活，都能阻礙細(xì)胞的

4、生長。本研究通過研究肝內(nèi)膽管癌中自噬的表達(dá)情況及其相關(guān)功能，并結(jié)合相關(guān)臨床資料分析Beclinl表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為進(jìn)一步研究自噬在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找肝內(nèi)膽管癌的預(yù)后相關(guān)分子和治療靶點提供了實驗和理論依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測膽管癌細(xì)胞系營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下自噬泡標(biāo)志分子LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平；
　　 2.膽管癌細(xì)胞系外轉(zhuǎn)GFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒，觀

5、察自噬泡的形成；
　　 3.電子透射顯微鏡觀察肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中的自噬小體；Real-time PCR檢測正常肝內(nèi)膽管上皮組織與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中自噬泡標(biāo)志分子LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平；
　　 4.應(yīng)用自噬抑制劑抑制膽管癌細(xì)胞的自噬水平，研究其對膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響；
　　 5.進(jìn)行膽管癌細(xì)胞系裸鼠體外荷瘤實驗，應(yīng)用自噬抑

6、制劑研究自噬對體外腫瘤生物學(xué)特性的影響；
　　 6.觀察自噬對膽管癌細(xì)胞系化療敏感性的影響；
　　 7.構(gòu)建自噬調(diào)控分子Beclinl的干擾病毒，下調(diào)膽管癌細(xì)胞系Beclinl的內(nèi)源表達(dá)水平，研究其對膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響；
　　 8.免疫組化檢測方法檢測肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中Beclinl的表達(dá)，結(jié)合患者臨床病理資料及預(yù)后資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下肝內(nèi)膽管癌細(xì)

7、胞系QBC939、RBE及HCCC-9810自噬活化水平升高；
　　 2.肝內(nèi)膽管癌組織中自噬通路高度激活。自噬相關(guān)基因Beclinl、atg5和atg7分別有87.8％、92.68％和85.36％高于正常膽管上皮組織的表達(dá)；自噬泡標(biāo)志分子LC3-Ⅱ有75％高于正常表達(dá)；
　　 3.應(yīng)用自噬抑制劑抑制膽管癌細(xì)胞的自噬后，膽管癌細(xì)胞系在饑餓狀態(tài)下增殖速度減慢，并且發(fā)生凋亡現(xiàn)象；
　　 4.自噬抑制劑能夠明顯抑制體外

8、QBC939細(xì)胞裸鼠種植腫瘤的生長；
　　 5.抑制自噬可以提高膽管癌細(xì)胞系的化療敏感性；
　　 6.內(nèi)源干擾膽管癌細(xì)胞系Beclinl的表達(dá)，能夠影響?zhàn)囸I狀態(tài)下膽管癌細(xì)胞周期進(jìn)程，降低細(xì)胞增殖速率，并且提高化療處理的凋亡發(fā)生率；
　　 7.肝內(nèi)膽管癌組織中自噬調(diào)控蛋白Beclinl低表達(dá)的患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。
　　 結(jié)論：
　　 膽管癌細(xì)胞水平的實驗證明自噬可以被營養(yǎng)缺乏的環(huán)境所

9、誘導(dǎo)，并且不論應(yīng)用自噬抑制劑還是siRNA內(nèi)源下調(diào)自噬通路激活水平，都可以影響膽管癌細(xì)胞的存活狀態(tài)，進(jìn)一步的實驗證實抑制自噬可以引起細(xì)胞周期G2M期阻滯和加速細(xì)胞凋亡性死亡，這或許是自噬參與維持細(xì)胞存活的兩條途徑；體外成瘤實驗也間接證實自噬是影響膽管癌腫瘤生長的因素之一；而結(jié)合人肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本中檢測到自噬通路處于較高水平活化狀態(tài)，提示人肝內(nèi)膽管癌特殊的低血供特點可能是誘發(fā)自噬的環(huán)境因素，自噬表達(dá)水平增高促進(jìn)癌細(xì)胞的存活并為維持其惡性