利用重組工程技術標記鼠疫菌染色體基因.pdf

1、背景：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(簡稱鼠疫菌)引起的自然疫源性烈性傳染病，可導致腺鼠疫和肺鼠疫。在人類歷史上因鼠疫而死亡的人數達數以億計。目前，鼠疫雖得到有效地控制，但鼠疫菌作為最為烈性的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑為恐怖組織所利用的可能性仍然存在。隨著對多種微生物基因組測序工作的完成，經典的遺傳學研究方式也在發(fā)生變化。基于重組工程技術的一步法突變和標記染色體基因已成為研究基因功能的重要手段。為加快研究鼠疫菌染色體基因及其產物的功能，將重組工程技術

2、應用于標記鼠疫菌染色體基因。 方法：將標簽序列合成于引物中，通過融合PCR的方法將標簽序列與卡那霉素或氯霉素抗性篩選基因連接構建融合模塊，再將標簽和抗性基因的融合模塊克隆到pBluescript載體，獲得模板載體。根據染色體目的基因的末端序列及其下游序列設計帶短同源臂引物(40-50bp)，從模板載體上PCR擴增染色體目的基因的重組標簽盒。將標簽盒電轉化進入表達Red重組系統(tǒng)的鼠疫菌感受態(tài)細胞，經同源重組表位標簽融合到目的基因的

3、下游，由此產生的C末端標記的融合蛋白可經標準的免疫學方法檢測。在本研究中，我們采用的表位標簽是Myc和6×His組和標簽，稱為MH標簽，所采用的抗性篩選標記是卡那霉素基因，標記的是鼠疫菌染色體fpoS基因(sigam因子)。重組標記克隆進行DNA序列分析，C末端標記的融合蛋白的表達通過針對Itis標簽的單克隆抗體進行Westernblot驗證。 結果：Myc-His組合標簽和卡那霉素抗性篩選基因的PCR融合產物成功的克隆到pBl