白術(shù)黃芪方、白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪注射液對(duì)Caco-2單細(xì)胞層屏障影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾胃為氣血生化之源，后天之本。脾的功能旺盛才能保證機(jī)體健康、抵御外邪侵襲。如《靈樞·五癃津液別》篇云：“脾為之衛(wèi)”。腸道擁有與外界相接觸的最廣大面積，許多毒素和致病因子如細(xì)胞因子等可經(jīng)破壞的腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)，不僅引起局部損害，亦可導(dǎo)致全身疾病。所以研究益氣健脾方藥對(duì)腸道屏障的作用具有重要的意義。 腸道屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障。腸道機(jī)械屏障主要由腸粘膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接等構(gòu)成

2、。腸上皮細(xì)胞包括多種生物功能不同的細(xì)胞，是腸道機(jī)械屏障的主要組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 腸上皮細(xì)胞之間一種特殊的膜性結(jié)構(gòu)——緊密連接(tightjunction)，位于基底外側(cè)細(xì)胞與細(xì)胞間的最上端，對(duì)來(lái)自于腸道的眾多毒素和免疫原起著首當(dāng)其沖的抵御作用，它是維持腸粘膜通透性(mucosapermeability)的重要組織成分，生理情況下只能允許2μm大小的離子或小分子物質(zhì)通過(guò)，以溝通機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境，緊密連接調(diào)節(jié)著離子、水分子、大分子甚至癌細(xì)

3、胞的通路，因此與水腫、腹瀉、血性轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；任何原因使緊密連接成分發(fā)生改變，或直接損傷了緊密連接，都會(huì)造成腸粘膜對(duì)腸內(nèi)容物的通透性增高，細(xì)菌或毒素等得以入侵體內(nèi)，激起一系列病理生理改變。 益氣健脾中藥是治療脾虛證的主要藥物，由黨參、白術(shù)、黃芪、甘草等為主要藥物組成的四君子湯、補(bǔ)中益氣湯、黃芪建中湯、參苓白術(shù)散、白術(shù)黃芪湯等是治療脾虛證的經(jīng)典方劑。益氣健脾中藥可通過(guò)影響腸道機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、生物屏障而發(fā)生作用。具體

4、體現(xiàn)在促進(jìn)腸上皮細(xì)胞修復(fù)、清除毒素和減少致炎因子、減少細(xì)菌移位和調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)、促進(jìn)腸道分泌SIgA、改善腸道血循環(huán)等方面。 現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為益氣健脾方藥能增強(qiáng)和調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的功能，對(duì)胃腸粘膜有增強(qiáng)屏障功能，有促進(jìn)粘膜防護(hù)因子分泌等作用。益氣健脾方藥主要用于治療有脾虛表現(xiàn)的病證，而脾虛證反映了以消化系統(tǒng)功能障礙為主的全身性綜合病理狀態(tài)，在脾虛患者或脾虛動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞連接可出現(xiàn)異常，因此益氣健脾中藥對(duì)脾虛證

5、的作用機(jī)理之一可能是對(duì)胃腸粘膜的保護(hù)或修復(fù)。 本實(shí)驗(yàn)室2000年引進(jìn)了大鼠小腸隱窩干細(xì)胞(intestinalepithelialcellline，IEC-6)，將其用于胃腸粘膜修復(fù)藥物作用的研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪注射液(主要含黃芪皂苷)可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞分化和遷移，亦可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞白介素6(IL-6)的分泌；白術(shù)AMPS-Ⅱ(主要含白術(shù)糖復(fù)合物)具有促進(jìn)IEC-6細(xì)胞分化的作用，可明顯改變IEC-6細(xì)胞的形態(tài)，其影響程

6、度與藥物作用的劑量和時(shí)間呈正相關(guān)，并可通過(guò)激活鳥(niǎo)氨酸脫羧酶促進(jìn)IEC-6細(xì)胞移行，可刺激IEC-6細(xì)胞的絨毛蛋白mRNA表達(dá)；甘草總黃酮可明顯促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖。 近年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)由白術(shù)、黃芪、甘草的有效提取部位所組成的新方白術(shù)黃芪方進(jìn)行了藥理研究。白術(shù)黃芪方來(lái)源于金元四大家之一劉完素的《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集·卷中·瀉痢論·第十九》中的：“白術(shù)黃芪湯：服前藥。痢雖已除。猶宜此藥和之?！仔g(shù)一兩，黃芪七錢(qián)，甘草三錢(qián)”?？梢?jiàn)白術(shù)

7、黃芪湯治療腸道炎性疾病緩解期、恢復(fù)期“痢”淵源已久。我們根據(jù)在細(xì)胞株和動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪總皂甘、甘草總黃酮經(jīng)均勻設(shè)計(jì)配伍組成新的方劑“白術(shù)黃芪方”，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方可以治療動(dòng)物潰瘍性結(jié)腸炎，減輕其炎癥程度，促進(jìn)損傷粘膜的修復(fù)。本論文根據(jù)以上工作基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究益氣健脾方藥對(duì)聚碳酸酯膜上培養(yǎng)的人結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2單細(xì)胞層的藥理作用，觀察白術(shù)黃芪方、白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪注射液對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖、單

8、細(xì)胞層通透性、緊密連接及其相關(guān)蛋白ZO-1表達(dá)的影響，從結(jié)腸上皮單細(xì)胞層形態(tài)和功能方面探討益氣健脾方藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的細(xì)胞藥理機(jī)制。 研究方法與結(jié)果1.MTT法觀察Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法：Caco-2細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞生物所。所用培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的DMEM。細(xì)胞以每孔3×105/mL接種于96孔板，每孔取0.1mL；在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)；每天取4孔，做MTT檢測(cè)。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱

9、軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 結(jié)果：Caco-2細(xì)胞在第1-7天呈增殖狀態(tài)，第8天開(kāi)始細(xì)胞數(shù)目下降。提示有密度抑制，故較適合在第1-7天進(jìn)行增殖、分化、蛋白表達(dá)等相關(guān)研究。 2.Caco-2單細(xì)胞層生長(zhǎng)的觀察實(shí)驗(yàn)方法：Caco-2細(xì)胞在95％空氣5％CO2的潮濕環(huán)境中，37℃條件下培養(yǎng)；3天傳代1次。細(xì)胞種植于單細(xì)胞層形成裝置(TranswellBicameralChambers，TBC)內(nèi)的聚碳酸酯膜上，同時(shí)按比例將細(xì)胞種植于

10、六孔板上做對(duì)照以觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)；于細(xì)胞種植后的不同天數(shù)分別在聚碳酸酯膜上層加入含有一定濃度酚紅的培養(yǎng)液，分別在加入后的2.5小時(shí)取聚碳酸酯膜上、下層液體0.5ml用分光光度計(jì)測(cè)定其酚紅含量；并在電鏡下觀察細(xì)胞連接情況。 實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞種植于聚碳酸酯膜上，同時(shí)按比例將細(xì)胞種植于六孔板上做對(duì)照以觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)；于細(xì)胞種植后的第二天，第三天，鏡下觀察細(xì)胞融合情況；細(xì)胞融合達(dá)80％左右，在聚碳酸酯膜上層加入含有酚紅和黃芪注射液(250

11、mg/L)的DMEM，分別在加入后的不同時(shí)間段，取聚碳酸酯膜下層液體0.5ml用分光光度計(jì)(波長(zhǎng)為560nm)測(cè)定其酚紅含量；并在電鏡下觀察細(xì)胞連接情況。 結(jié)果：250mg/L濃度的黃芪注射液可降低Caco-2單細(xì)胞層的通透性，聚碳酸酯膜下層酚紅含量測(cè)定吸光度值分別在4小時(shí)、10小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)較空白組低92.0％、69.5％、43.6％、49.5％、53.9％。與空白組比P＜0.05。電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞絨毛面有微

12、絨毛，其所對(duì)應(yīng)的下面出現(xiàn)似粘附連接結(jié)構(gòu)；并在觀察視野中多處出現(xiàn)明顯的橋粒結(jié)構(gòu)。空白對(duì)照組則無(wú)明顯的橋粒等細(xì)胞連接形成。 5.2免疫熒光法觀察黃芪注射液對(duì)細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1表達(dá)影響的影響實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞接種于有蓋玻片的六孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80％左右添加250mg/L濃度的黃芪注射液繼續(xù)培養(yǎng)；24小時(shí)后用PBS漂洗，取出蓋玻片后，用95％酒精(或冷丙酮)固定，PBS漂洗；加入TritonX-100處理10min，PBS

13、漂洗；小牛血清白蛋白封閉，加入ZO-1抗體，4℃過(guò)夜，PBS漂洗后加入用FITC標(biāo)記的免疫熒光抗體1h，再用PBS漂洗，蒸餾水洗后用甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果：250mg/L濃度的黃芪注射液組細(xì)胞膜附近ZO-1所在位置熒光信號(hào)強(qiáng)度與空白組相比未見(jiàn)明顯差異，提示250mg/L濃度的黃芪注射液對(duì)ZO-1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。 5.3WesternBlot法觀察黃芪注射液對(duì)細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)方法

14、：細(xì)胞接種于六孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80％左右添加250mg/L濃度的黃芪注射液繼續(xù)培養(yǎng)；24h后用PBS漂洗，用含有Tris-Hcl(pH7.5)、EDTA(乙二胺四乙酸)、苯甲基磺酰氟(PMSF)Aprotinin(抑蛋白酶肽等的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；Bradford法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行免疫印跡；顯/影定影；凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。 結(jié)果：膠片上250mg/L濃度的黃芪注射液組灰度與空白相比未

15、見(jiàn)明顯不同，提示250mg/L濃度的黃芪注射液對(duì)ZO-1蛋白的表達(dá)無(wú)影響。 結(jié)論白術(shù)黃芪方可以治療三硝基苯磺酸所致動(dòng)物潰瘍性結(jié)腸炎，減輕其炎癥程度，促進(jìn)損傷粘膜的修復(fù)。本研究在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)黃芪方有促進(jìn)人腸上皮Caco-2細(xì)胞增殖的傾向、亦可促進(jìn)Caco-2單細(xì)胞層緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1的表達(dá)，這可能是術(shù)黃芪方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點(diǎn)和物質(zhì)基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)還對(duì)白術(shù)黃芪方的君藥白術(shù)、臣藥黃芪做了相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)