白術黃芪方對潰瘍性結腸炎及緊密連接相關蛋白影響的實驗研究.pdf

1、一、研究背景與目的：脾虛證反映了以消化系統(tǒng)功能障礙為主的全身性綜合病理狀態(tài)，有消化吸收功能障礙、胃腸屏障功能低下等表現(xiàn)。脾虛證主要以益氣健脾法治療，代表藥物有黨參、白術、黃芪、茯苓、甘草等，以其為主組成的經(jīng)典方劑有四君子湯、補中益氣湯、參苓白術散、黃芪建中湯等。許多研究表明，脾虛患者和脾虛動物存在腸上皮細胞形態(tài)和功能的病變，通過益氣健脾方藥治療可得到明顯改善。表明這類中藥有維持腸上皮完整、改善上皮細胞功能和保護腸粘膜等作用。但國內對益氣

2、健脾中藥腸粘膜修復作用機理的研究不多。 本實驗室近年來開展了相關研究，以化學方法提取得到黨參、白術、黃芪和甘草的提取部位18個，發(fā)現(xiàn)一些提取部位能促進小腸隱窩IEC-6細胞增殖、移行、分化，促進細胞內鳥氨酸脫羧酶(ODC)、絨毛蛋白、轉鐵蛋白等表達，提高多胺(腐胺)含量等，最后篩選出3個有較強藥理活性的提取部位白術AMPS-Ⅱ、黃芪總皂苷、甘草總黃酮，并對其進行了提取工藝研究，各有效組分均達到中藥新藥有效部位的要求，在動物實驗中

3、以均勻設計法得出其最佳配伍比例，設立了由白術AMPS-Ⅱ、黃芪總皂苷、甘草總黃酮組成的白術黃芪方提取物新組方(以下簡稱白術黃芪方)。組方思路源自金元醫(yī)家劉完素的白術黃芪湯，其《素問病機氣宜保命集·瀉痢論》曰：“白術黃芪湯：服前藥，痢雖己除，猶宜此藥和之。……白術一兩，黃芪七錢，甘草三錢。”按原文所述，白術黃芪湯主要在瀉痢已除之后應用，以達調理脾胃、“和之”的目的，類似瀉痢恢復期和潰瘍性結腸炎緩解期的治療。其療效可能與促進腸粘膜修復、保護

4、腸上皮屏障的相關。因此益氣健脾中藥的作用靶點除了ODC和多胺等機制外，腸上皮細胞連接作為腸粘膜屏障的重要組成部分也可能是其靶點之一。本實驗室最近觀察了白術黃芪方對細胞緊密連接及其相關蛋白ZO-1的影響，結果表明該方可促進腸上皮Caco-2細胞增殖，增強ZO-1蛋白表達，白術AMPS-Ⅱ和黃芪皂苷可促進腸上皮細胞連接的形成從而促進細胞分化(尚未發(fā)表資料)。 在以上工作基礎上，本研究根據(jù)白術黃芪湯的臨床功用，選擇腸粘膜損傷性疾病潰瘍

5、性結腸炎(屬于中醫(yī)“下痢”范疇)為研究對象，考察白術黃芪方經(jīng)過藥物提取、篩選、組方后的白術黃芪方，新方與原方湯劑比較，其適應癥、藥效、毒性等情況。研究目的是觀察白術黃芪方是否使療效增加而不引起毒性增加，是否保留其治療瀉痢恢復期脾胃虛弱的功效，是否保持中藥配伍組方能增效的特點，其作用機理是否與腸上皮細胞緊密連接及其相關蛋白(選擇構成緊密連接的重要蛋白claudin-1、occludin)有關等。研究內容包括建立適用于中醫(yī)藥治療漬結病程發(fā)展

6、特點的動物模型；比較白術黃芪方和白術黃芪湯治療潰瘍性結腸炎的療效及其毒性；觀察白術黃芪方對潰瘍性結腸炎不同病變階段的療效及其對claudin-1、occludin蛋白的影響，以考察該方益氣健脾治療潰瘍性結腸炎恢復期的功效及其對腸粘膜屏障可能的作用機理。本研究在中醫(yī)藥理論指導下，應用現(xiàn)代科學方法進行觀察，研究結果有助于闡述益氣健脾中藥治療腸道疾病的作用機理和物質基礎。 二、研究方法1、三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結腸炎建模方法的改良為

7、了使動物模型更加接近臨床潰瘍性結腸炎緩解期的情況，模擬白術黃芪湯“痢雖已除，猶宜此藥和之”的方證，用于研究觀察白術黃芪方(湯)的療效及其作用機制。 2、白術黃芪方與白術黃芪湯治療大鼠潰瘍性結腸炎的療效比較大鼠TNBS(50mg/kg)造模后，分為模型組、白術黃芪方0.3g/kg組、白術黃芪湯15g/kg組，每組16只大鼠，灌胃給藥14天后處死。觀察大鼠一般狀態(tài)、結腸病變的肉眼評分、組織病理學評分以及超微結構，比較在兩藥在使用藥材

8、量大致相當?shù)那闆r下其療效的差異。 3、白術黃芪方拆方對結腸炎小鼠髓過氧化物酶的影響TNBS致小鼠結腸炎模型，觀察白術AMPS-Ⅱ、黃芪總皂苷、甘草總黃酮、白術AMPS-Ⅱ+黃芪總皂苷、白術黃芪方(以上5組劑量均為0.2g/kg)對小鼠髓過氧化物酶的影響，另設模型組、陽性對照藥潑尼松組、正常組。各組灌胃10天后處死小鼠，取結腸勻漿測髓過氧化物酶(MPO)。 4、白術黃芪方對大鼠潰瘍性結腸炎不同病變階段病變的影響TNBS致潰

9、瘍性結腸炎大鼠分為模型組和白術黃芪方組，每組48只大鼠，造模后分別灌胃給藥，兩組各在造模的實驗早、中、后期(10天、20天、30天)分3批處死大鼠，另設正常對照組，觀察大鼠一般狀態(tài)、結腸病變的肉眼和組織病理學評分情況，以考察白術黃芪方對大鼠潰瘍性結腸炎急性期、緩解期和恢復期的影響。 5、白術黃芪方對潰瘍性結腸炎緊密連接相關蛋白claudin-1、occludin的影響“實驗4”的大鼠結腸標本以免疫熒光法檢測claudin-1、o

10、ccludin的表達，考察大鼠潰瘍性結腸炎claudin-1、occludin蛋白表達情況，白術黃芪方對其表達有否影響。 6、白術黃芪方與白術黃芪湯急性毒性試驗白術黃芪方與白術黃芪湯一次灌胃均不引起小鼠死亡，故測一次最大耐受量。以兩藥最大濃度最大體積給小鼠一次灌胃，正常飼養(yǎng)7天以觀察其毒性反應。 三、研究結果1、建立TNBS致大鼠潰瘍性結腸炎改良模型方案1：死亡率90％(9/10)，結腸肉眼評分5.9±0.3。方案2：死

11、亡率66.7％(6/9)，結腸肉眼評分5.0±1.7。方案3：死亡率18.2％(2/11)，結腸肉眼評分4.3±1.3。方案4：死亡率37.5％(6/16)，結腸肉眼評分4.0±1.8。提示造模方案可選擇SD大鼠體重220-240g，TNBS劑量50-60mg/kg，死亡率控制在20％以內比較合適。 2、白術黃芪方與白術黃芪湯治療大鼠潰瘍性結腸炎的療效比較實驗結束后結腸肉眼評分：模型組4.0±1.8，白術黃芪方組2.8±1.5，

12、白術黃芪湯組3.4±1.7，經(jīng)秩和檢驗白術黃芪方組與模型組比較P＜0.05；病理組織學評分：模型組4.7±1.2，白術黃芪方組3.1±1.6，白術黃芪湯組4.6±1.4，經(jīng)秩和檢驗白術黃芪方組與模型組、白術黃芪湯組比較均P＜0.05。表明白術黃芪方治療大鼠潰結的療效優(yōu)于白術黃芪湯。結腸超微結構觀察表明大鼠潰瘍性結腸炎有緊密連接形態(tài)結構的破壞，白術黃芪方治療后能得到改善。 3、白術黃芪方提取部位單用及配伍組方對結腸炎小鼠MPO的影

13、響模型組MPO明顯高于正常組，表明造模成功。白術AMPS-Ⅱ、白術AMPS-Ⅱ+黃芪總皂苷、白術黃芪方都能降低MPO含量(P＜0.05-0.01)，表明對小鼠結腸炎有抗炎作用；白術AMPS-Ⅱ+黃芪總皂苷組效果略優(yōu)于白術AMPS-Ⅱ組，白術黃芪方組效果最好。單用黃芪總皂苷、甘草總黃酮則對MPO無明顯影響。 4、白術黃芪方對不同病變階段大鼠潰瘍性結腸炎病變的影響實驗10天、20天、30天，結腸肉眼評分：模型組為5.2±1.0，4.

14、3±1.3，3.5±1.6；白術黃芪方組為4.5±1.5，3.8±1.7，2.6±1.5，白術黃芪方與同時段的模型組比較秩和檢驗，造模30天時P＜0.05；病理組織學評分：模型組為7.8±0.6，6.5±2.5，5.6±1.7，白術黃芪方組為8.0±0.0，6.4±1.3，4.9±2.0；白術黃芪方組與同時段的模型組比較P＞0.05。 5、白術黃芪方對大鼠潰結緊密連接相關蛋白claudin-1、occludin的影響在“實驗4”

15、的結腸標本中，組織病理學情況包括正常組織、潰結病灶部位(原有組織結構被破壞，明顯炎細胞浸潤、滲出、壞死、或有肉芽組織增生、潰瘍修復、早期瘢痕形成等)、潰結病灶邊緣組織(局部可見原有的組織結構如腸粘膜、粘膜下層、肌層等，但有炎細胞浸潤)、離潰結病灶較遠的部位(原有的組織結構基本保留，炎細胞浸潤相對較少)。 6、白術黃芪方與白術黃芪湯急性毒性試驗白術黃芪方與白術黃芪湯灌胃后小鼠活動正常，無一死亡。白術黃芪湯一次最大耐受量為60g生藥

16、/kg，相當于臨床用量的180倍；白術黃芪方一次最大耐受量為4g提取物/kg，約相當于180g生藥/kg。提示兩方臨床用量均在安全范圍。 四、結論1、TNBS致大鼠潰瘍性結腸炎的病變從急性炎癥、組織壞死階段發(fā)展到慢性炎癥、潰瘍修復階段，與臨床潰瘍性結腸炎有相似之處，與中醫(yī)證型病機演變也有相符之處。但影響該模型病變程度的因素較多，包括造模劑量、實驗周期、動物體重與品種等，因此每次實驗應以少量同批動物做預實驗來確定正式實驗的造模方案

17、。 2、白術黃芪方治療潰瘍性結腸炎的效果優(yōu)于白術黃芪湯；白術黃芪方有效部位配伍、組方后，其降低結腸炎小鼠髓過氧化物酶的作用優(yōu)于單用，提示用方劑中各藥的有效部位進行配伍組方，達到了增效的目的；白術黃芪方經(jīng)有效部位提取后沒有增加毒性。 3、大鼠潰瘍性結腸炎可見腸上皮細胞緊密連接結構形態(tài)的破壞，白術黃芪方治療后獲得改善，推測其作用機理可能與該方對緊密連接相關蛋白claudin-1、occludin的影響有關。但“實驗5”的結果