龍葵素及莨菪烷類生物堿的中毒、檢測及評價研究.pdf

1、茄科植物對于人類是非常重要的一大科植物，可為人類提供許多種食物和藥物，也是有毒植物最重要的科之一。茄科植物的化學成分特征是含有多種莨菪烷類、甾體類和吡啶類生物堿，其中，甾體類生物堿，如龍葵素、澳茄堿等多具抗菌消炎和抗霉菌作用，主要存在于茄屬植物如馬鈴薯中；莨菪烷類生物堿，如阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿，為抗膽堿藥物，能擴瞳、解攣、止痛及抑制腺體分泌，多存在于曼陀羅屬植物如洋金花中。在我國民間，此類植物常被作為中草藥服用，如含龍葵素的植物龍

2、葵等，經(jīng)炮制后用于治療癌癥及風濕病等；含莨菪烷類生物堿的植物如洋金花等常被泡入酒中作藥酒飲用。由于這些植物所含化學成分復雜多樣、且含量低毒性大，服用者常因用藥不當、過量服用導致中毒或死亡。龍葵素存在于日常食用的主要糧食作物馬鈴薯中，尤其是在變綠發(fā)芽的馬鈴薯中其含量更高，故實踐中常發(fā)生因食用了發(fā)芽的馬鈴薯而引發(fā)的中毒案（事）件，且常為群體性中毒事件。
　　茄科植物中毒的鑒定及評價技術是法醫(yī)毒物學研究涉及尚少的領域，由于茄科植物所含成

3、分多樣、體內(nèi)含量低、樣品處理復雜而成為法醫(yī)毒物鑒定的難點問題。雖有相關分析方法和藥代方面的零星研究報道，但技術平臺、檢測對象和方法學指標均難以滿足毒物鑒定實踐的需求和科學證據(jù)的要求?；谏鲜霰尘昂托枨?，本研究在現(xiàn)代分析技術的平臺上，綜合運用液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-(MS)n）的高分離效能和結構確證功能，研究、開發(fā)、建立液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法，分析和評價復雜生物體系中龍葵素和莨菪烷類生物堿；設計、初步創(chuàng)建甾體類生物堿龍葵素的中毒實驗

4、模型，考察目標物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等毒代動力學相關問題，探索、確立有毒動植物中毒鑒定的取材方案和評判依據(jù)，為有毒動植物的科學研究、中毒鑒定、臨床診斷及救治、食品安全監(jiān)測等提供技術平臺，為實際中毒案例提供評價基礎和參考信息。
　　本論文的研究內(nèi)容共分為四章。
　　第一章創(chuàng)建了生物體液及組織中龍葵素的固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質譜（SPE-LC-MS/MS）的分離分析方法，以及進行的全面系統(tǒng)的方法學驗證。方法以美替諾

5、龍醋酸酯為內(nèi)標，血液、尿液及肝組織中的龍葵素經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱富集、純化后，LC-MS/MS法檢測龍葵素中兩種主要成分α-茄堿和α-卡茄堿，方法的檢測時間為7min。血液、尿液及組織中α-茄堿和α-卡茄堿與內(nèi)標美替諾龍醋酸酯分離良好。血液和尿液中α-茄堿和α-卡茄堿在0.5-100ng/mL內(nèi)均有良好的線性，相關系數(shù)＞0.995，最低檢出限均為0.2ng/mL?；厥章示笥?0%，基質效應為45%-79%。方法的準確度在80

6、%-120%之間，日內(nèi)精密度與日間精密度（RSD）均小于10%。所建方法靈敏度高、選擇性好，前處理方法方便有效，可用于法醫(yī)毒物分析和臨床藥物檢測及食品安全監(jiān)測中龍葵素的測定。
　　第二章初步建立了馬鈴薯提取物-龍葵素的中毒實驗模型。通過動物實驗，觀察龍葵素給藥后，動物的中毒癥狀以及變化。運用本研究創(chuàng)建的SPE-LC-MS/MS方法，研究龍葵素的毒性劑量下對大鼠單次灌胃給藥后，其兩種主要成分：α-茄堿和α-卡茄堿在血液中的濃度隨時間

7、變化的趨勢，尿液中的排泄情況以及龍葵素致大鼠急性中毒死亡后的組織分布情況。結果表明在本研究的給藥劑量下，α-茄堿和α-卡茄堿在血液中的濃度隨時間的變化有兩種趨勢，大鼠對龍葵素的吸收存在著較明顯的個體差異。排泄研究表明，龍葵素以藥物原形隨尿液排出量較少，可推測以其他形式排出體外。大鼠急性中毒死亡后組織分布的研究結果表明，α-茄堿α-卡茄堿在各組織中的分布情況基本一致，在小腸、胃、肝、腎中含量較高；研究還表明雌性大鼠的生殖器官中（子宮和卵巢

8、）藥物的濃度較雄性大鼠生殖器官中（睪丸）的藥物濃度大，兩者有著明顯的差別。研究結果可對龍葵素中毒鑒定及評價提供指導信息和參考依據(jù)。
　　第三章創(chuàng)建了血液和尿液中的3種莨菪烷類生物堿的LC-MS/MS檢測方法，以及進行的全面系統(tǒng)的方法學驗證。血液或尿液以后馬托品為內(nèi)標，經(jīng)液液提取后，LC-MS/MS法分析阿托品、東莨菪堿及山莨菪堿。血液、尿液中阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿與內(nèi)標后馬托品分離良好，3種化合在0.05-100ng/mL（血

9、液）、0.2-100ng/mL（尿液）內(nèi)均有良好的線性，相關系數(shù)>0.9990，最低檢出限為0.02ng/mL。方法回收率除山莨菪堿外均大于50%，日內(nèi)精密度與日間精密度（RSD）均小于10%。所建立的LC-MS/MS方法靈敏度高、操作簡便快速、準確，適用于血液及尿液等生物檢材中痕量阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿成分的同時檢測。
　　第四章總結了本論文課題的研究成果及創(chuàng)新點，并提出進一步的研究方向，為深入探討龍葵素或莨菪烷類生物堿的中

10、毒鑒定與評價提供研究基礎。
　　本論文的創(chuàng)新點及研究意義如下：
　　1.本研究創(chuàng)建的血液、尿液及組織中的龍葵素定性定量分析方法簡單、快速、靈敏、可靠，為國內(nèi)首創(chuàng)的生物檢材中龍葵素的分析方法，較國外已有方法更簡便、快速，適用于龍葵素中毒的法醫(yī)學鑒定、臨床診治及食品安全監(jiān)測。
　　2.首次研究了馬鈴薯龍葵素提取物的毒性劑量下，α-茄堿和α-卡茄堿在大鼠體內(nèi)的血藥濃度隨時間的變化趨勢。初步考察了α-茄堿和α-卡茄堿在體內(nèi)的毒

11、代動力學情況。初步考察了毒性劑量下龍葵素隨尿液的排泄情況。
　　3.首次研究了在龍葵素急性中毒死亡的大鼠組織中α-茄堿和α-卡茄堿的分布特征；并首次考察在大鼠生殖器官中的分布狀況，發(fā)現(xiàn)α-茄堿和α-卡茄堿在雌性、雄性大鼠生殖器官中的分布存在較明顯的差異。
　　4.創(chuàng)建了同時快速分析生物檢材中3種莨菪烷生物堿的LC-MS/MS方法，所建方法簡便、靈敏、快速、可靠，能滿足曼陀羅中毒后生物檢材中東莨菪堿、阿托品、山莨菪堿的同時檢測