蝦夷扇貝NF-κB家族基因和Tollip基因鑒定及表達(dá)分析.pdf

1、蝦夷扇貝（Patinopectenyessoensis）自1982年從日本引進(jìn)以后，大大推動(dòng)了中國(guó)北方養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，已經(jīng)成為我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類之一。近幾年來(lái)，由于大規(guī)模細(xì)菌性疾病的爆發(fā)，扇貝死亡率逐年升高，導(dǎo)致了大量的經(jīng)濟(jì)損失。為了給扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供幫助，其重要潛在抗病基因和抗逆基因的鑒定顯得愈發(fā)重要。固有免疫系統(tǒng)是大多數(shù)物種應(yīng)對(duì)各種感染時(shí)所采取基本防御策略中的第一道防線，在物種生存和生命延續(xù)中起著至關(guān)重要的作用。作為免疫防御機(jī)

2、制啟動(dòng)的關(guān)鍵步驟，能夠激活下游免疫相關(guān)基因的TLR信號(hào)通路(Toll-like receptorsignaling pathway)自然成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。
　　1.蝦夷扇貝NF-kB家族基因鑒定及表達(dá)分析
　　NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)家族基因進(jìn)化保守并參與多種生理學(xué)過(guò)程，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中得到了廣泛的研究

3、。然而，其在雙殼類動(dòng)物中并沒有進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定。本論文從蝦夷扇貝中鑒定出了兩個(gè)NF-κB家族基因:PyNF-κB和PyRel。PyNF-κB基因由長(zhǎng)度為54bp至774bp的21個(gè)外顯子組成，其開放讀碼框（open reading frame）為3465bp，編碼1154個(gè)氨基酸;PyRel基因由長(zhǎng)度為72bp至660bp的12個(gè)外顯子組成，其開放讀碼框?yàn)?920bp，編碼639個(gè)氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)生分析用來(lái)證實(shí)其身份和進(jìn)化地位

4、。PyNF-κB蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)擁有43個(gè)α螺旋、76個(gè)β折疊片、94個(gè)卷曲螺旋和90個(gè)轉(zhuǎn)角;PyRel蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)擁有16個(gè)α螺旋、41個(gè)β折疊片、56個(gè)卷曲螺旋和54個(gè)轉(zhuǎn)角。PyNF-κB和PyRel與其它軟體動(dòng)物Rel/NF-κB蛋白擁有較高的相似度，包括進(jìn)化保守的1個(gè)RHD功能域(Relhomology domain)和1個(gè)IPT功能域(Ig-like，plexins，transcription factor domai

5、n)，還有兩個(gè)保守的模塊。此外，PyNF-κB擁有1個(gè)DEATH功能域(death domain)和6個(gè)ANK功能域(ankyrin domain)，但TAD功能域(transcription activationdomain)并沒有在PyRel蛋白中預(yù)測(cè)到。所有Rel/NF-κB蛋白分成兩大進(jìn)化支，相較于脊椎動(dòng)物Rel/NF-κB而言，PyNF-κB和PyRel在結(jié)構(gòu)上進(jìn)化保守，但和其它無(wú)脊椎動(dòng)物一樣沒有旁系同源。為了進(jìn)一步探索蝦夷扇

6、貝NF-κB家族基因的作用，利用Real-time qRT-PCR對(duì)蝦夷扇貝在不同發(fā)育時(shí)期、健康成體組織和受到藤黃微球菌、鰻弧菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)(3，6，12和24h)血細(xì)胞的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，PyNF-κB前四個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平顯著高于其它時(shí)期，包括卵母細(xì)胞、受精卵、多細(xì)胞期、囊胚期;PyRel則在原腸胚期、擔(dān)輪幼蟲期和D型幼蟲期的表達(dá)水平較高。在成體組織中，PyNF-κB和PyRel普遍表達(dá)，并在免疫相關(guān)組織中高表達(dá)。受到

7、藤黃微球菌和鰻弧菌侵染后，PyNF-κB和PyRel在3h時(shí)都顯著上升，PyNF-κB更加劇烈的波動(dòng)變化暗示了在對(duì)抗革蘭氏陰性細(xì)菌侵染時(shí)，蝦夷扇貝可能存在IMD補(bǔ)償信號(hào)通路(immune deficiency signalingpathway)。這個(gè)復(fù)雜的表達(dá)模式表明了PyNF-κB和PyRel在免疫響應(yīng)中具有特異和協(xié)同作用。
　　2.蝦夷扇貝Tollp基因鑒定及表達(dá)分析
　　Tollip(Toll-interacting

8、protein)是TLR介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，但其在貝類動(dòng)物中并沒有進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定。本論文鑒定了PyTolip，并進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)生分析。PyTollip基因由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成;其eDNA全長(zhǎng)為3815bp，擁有一個(gè)73bp的5'UTR、一個(gè)2875 bp的3'UTR和一個(gè)867bp編碼288個(gè)氨基酸的開放讀碼框。其蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)擁有11個(gè)α螺旋、20個(gè)β折疊片、30個(gè)卷曲螺旋和27個(gè)轉(zhuǎn)角。根據(jù)蛋

9、白多序列比對(duì)結(jié)果，PyTollip與人、鼠和紫貽貝的一致性分別為50％、49％和64％。相較于其它脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物Tollip而言，除了在C2功能域(central conserved2 domain)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)明顯的殘基替換(N150)，PyTollip在序列和結(jié)構(gòu)特征上都高度保守，其65-162位氨基酸區(qū)域?yàn)镃2功能域，244-286位氨基酸區(qū)域?yàn)镃UE功能域(coupling of ubiquitin to endoplas

10、mic reticulum degradation domain)。對(duì)PyTollip的表達(dá)分析是在蝦夷扇貝的不同發(fā)育時(shí)期、健康成體組織和受到藤黃微球菌、鰻弧菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)(3，6，12和24h)的血細(xì)胞中進(jìn)行的。Real-time qRT-PCR結(jié)果表明，受到藤黃微球菌和鰻弧菌侵染后，PyTollip在3h時(shí)都顯著上升。而受到鰻弧菌侵染24h時(shí)，PyToHip的表達(dá)量又出現(xiàn)了一個(gè)顯著的升高。這一現(xiàn)象為Tolip和TLR信號(hào)通路在扇