水通道蛋白-1(AQP-1)在結(jié)直腸癌組織中的表達及其與腫瘤微血管形成的關(guān)系研究.pdf

1、目的:水是細胞和細胞間隙的主要成份,細胞內(nèi)外一切生命活動都是在水的微環(huán)境中進行的,在消化、呼吸、循環(huán)、體溫調(diào)節(jié)、毒素的清除以及神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種機體活動中都存在水的跨細胞膜轉(zhuǎn)運。水通道蛋白(aquaporins,AQP)是對水專一的通道蛋白,普遍存在于動、植物及微生物中,它所介導的自由水快速被動的跨生物膜轉(zhuǎn)運,是水進出細胞的主要途徑。到目前為止,已克隆的哺乳動物水通道家族有13個成員(AQP0-AQP-12),其基因結(jié)構(gòu)、基因表達調(diào)控

2、、染色體定位、蛋白結(jié)構(gòu)、組織分布和生理功能得到了較為廣泛的研究。
　　 更深入的研究表明,為滿足快速增殖、分裂和侵襲轉(zhuǎn)移的需要,腫瘤細胞一系列酶的活性和表達發(fā)生改變,細胞基本結(jié)構(gòu)成分如蛋白質(zhì)、脂類和核酸的合成加強,甚至核酸合成的基本原料--核苷酸的生物合成明顯加強,以至蛋白表達譜系或蛋白活性都有改變;同時腫瘤細胞向周圍基質(zhì)侵襲和進出血管、淋巴管時需要其體積和外形應有所改變。腫瘤細胞的所有這些生命活動都離不開水的微環(huán)境和參與,腫瘤

3、細胞比正常細胞更需要水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運。隨著研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)水通道蛋白在一些病理過程,特別是在某些惡性腫瘤中存在表達異常,并由此提出,水通道蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及血管形成過程中可能扮演重要角色,目前這方面已成為研究熱點。
　　 結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,在北美洲、歐洲,結(jié)直腸癌已經(jīng)上升為惡性腫瘤的第2位,在我國則占據(jù)常見惡性腫瘤的第3位到第4位。數(shù)據(jù)顯示,我國城市地區(qū)結(jié)直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第4位,而在北

4、京和上海等大城市,其發(fā)病率已上升至第2-3位,已經(jīng)接近西方發(fā)達國家結(jié)直腸癌的發(fā)病率。
　　 目前結(jié)直腸癌的治療手段主要為外科手術(shù)、放療及化療,這些治療方式不僅對腫瘤細胞有治療作用,也同時影響到非腫瘤組織,造成嚴重的毒副反應。靶向治療針對與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的異常的細胞信號傳導通道,因此對非腫瘤組織的影響很小,相信不久的將來分子靶向治療將成為治療結(jié)直腸癌的主要手段之一。
　　 腫瘤血管生成(angiogenesis)即血液

5、或骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞形成新血管,在腫瘤的生長與發(fā)展中具有重要作用。腫瘤的生長與擴散均依賴于其周圍血管的生長和對外侵襲,新生的腫瘤血管為腫瘤組織提供新陳代謝所必需的氧氣和營養(yǎng),從而使腫瘤得以迅速的生長。VEGF/VEGFR通路是腫瘤血管生成的主要信號通路。研究證明,AQP-1對細胞遷移具有促進作用。內(nèi)皮細胞的遷移是血管新生中的必要過程,因此AQP-1對腫瘤血管新生的作用可能是通過促進內(nèi)皮細胞遷移完成的。
　　 AQP屬于小分子疏

6、水性內(nèi)在膜蛋白家族,目前發(fā)現(xiàn)有13種。近年來研究表明,AQP參與了哺乳動物的一些重要的生理病理學過程,如尿濃縮、腦水腫的形成、眼內(nèi)壓的調(diào)節(jié)、脂肪代謝、外分泌腺分泌、腫瘤血管發(fā)生等。AQP-1是Agre等于1992年首次從紅細胞膜發(fā)現(xiàn)第一個水通道蛋白,并因此獲得2003年度諾貝爾化學獎。AQP-1是紅細胞膜的主要水通道,原名為通道形成跨膜蛋白(Channel forming integral protein,CHIP28),其蛋白分子中含

7、有269個氨基酸。
　　 AQP-1與腫瘤的血管發(fā)生與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,它在許多腫瘤的微血管內(nèi)皮細胞上均有表達。缺乏AQP-1的小鼠腫瘤血管發(fā)生與內(nèi)皮細胞遷移明顯受損。與野生型小鼠相比,AQP-1基因敲除小鼠體內(nèi)植入腫瘤的生長速度明顯減慢,組織學顯示,腫瘤內(nèi)的微血管密度降低、壞死組織區(qū)域變大。在原代培養(yǎng)主動脈內(nèi)皮細胞的研究中進一步征實,缺乏AQP-1的內(nèi)皮細胞遷移速率明顯變慢。究其原因可能是細胞在遷移時需要細胞膜形成短暫的突出,在

8、此過程中需要快速的局部跨膜離子流和水轉(zhuǎn)運,缺乏AQP-1介導的快速水轉(zhuǎn)運,細胞膜突出不能形成,細胞遷移速率會明顯減慢。另有研究表明抑制AQP-1可能會減少一些腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。因此,抑制AQP-1可以延緩腫瘤的血管發(fā)生,阻止腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。
　　 Endo等發(fā)現(xiàn)AQP-1在腫瘤組織中高度表達,指出其可能參與了腫瘤血管的新生作用。Saadoun等研究發(fā)現(xiàn),AQP-1對惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有重要作用。因此,調(diào)節(jié)AQP-1表達的藥物具有

9、廣闊的治療應用前景。盡管目前還沒有發(fā)現(xiàn)有效的AQP-1調(diào)節(jié)劑,該蛋白目前仍是一個潛在的藥物靶點,本研究希望為證明該靶點的作用帶來希望。
　　 方法:
　　 1采用免疫組織化學、RT-PCR的方法檢測30例結(jié)直腸癌組織中AQP-1的表達情況,并且分析其與結(jié)直腸癌臨床病理資料,包括年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期之間的相關(guān)性。
　　 2采用免疫組織化學方法檢測30例結(jié)直腸癌組織中AQP-

10、1、VEGF、CD34的表達,計算腫瘤組織微血管密度,分析AQP-1與VEGF、CD34的相關(guān)性。
　　 3將人結(jié)腸癌HT-29細胞注射于裸鼠背部皮下建立移植瘤模型,16天后,將裸鼠隨機分為兩組:空白對照組;乙酰唑胺組(40mg/kg/d)。并給予相應的藥物。每3天測量腫瘤體積,給藥21天后,處死裸鼠,切取移植瘤組織檢測AQP-1與VEGF、CD34蛋白和AQP-1mRNA的表達,分析AQP-1與VEGF、CD34的相關(guān)性。

11、r>　　 結(jié)果:
　　 1 AQP-1主要在結(jié)直腸癌組織中的癌細胞漿呈高表達,而在癌旁組織的正常細胞漿呈低表達。免疫組化評分(HIS)分別為:結(jié)直腸癌組織3.17±2.23,正常腸粘膜上皮1.07±1.01,差異有統(tǒng)計學意義(F=4.83,P＜0.0001)。AQP-1mRNA表達癌旁組織為0.52±0.29,結(jié)直腸癌組織為1.26±0.27,兩組差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AQP-1的表達與年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深

12、度和分化程度無明顯相關(guān)(P＞0.05),而與腫瘤Duke's分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。
　　 2 AQP-1、VEGF及CD34不同程度地表達于癌組織及癌旁組織,兩組之間的差異具有顯著性的意義,AQP-1和VEGF在結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(rs=0.482,P＜0.01),提示AQP-1與VEGF表達在結(jié)直腸癌發(fā)生中有相互作用,共同參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展及腫瘤血管生成,均可作為反映結(jié)直腸癌生物學行為的客

13、觀參考指標;AQP-1與MVD在結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(rs=0.510,P＜0.01),說明AQP-1在結(jié)直腸癌的新生血管形成過程中起著非常重要的作用,而在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程中,血管的生成又為其提供了必須的物質(zhì)基礎和轉(zhuǎn)移通道,AQP-1在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起促進癌細胞生長、轉(zhuǎn)移和具有血管生成作用。
　　 3通過建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型,然后用水通道蛋白抑制劑乙酰唑胺灌胃給藥治療,兩組移植瘤體積、瘤重比較差異

14、有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。并且計算腫瘤抑制率達88.28％。試驗組與對照組相比水通道蛋白-1蛋白和mRNA的表達明顯減少,AQP-1蛋白表達:試驗組為0.5344±0.2535,對照組為0.8156±0.1954,(P=0.0121＜0.05);AQP-1mRNA表達:試驗組為0.52±0.29,對照組為1.26±0.27(P＜0.001)。兩組裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤AQP-1、VEGF和CD34之間的表達差異及試驗組AQP-1、VEG

15、F和CD34相關(guān)性分析證實,AQP-1、VEGF及CD34不同程度地表達于對照組及試驗組,兩組HIS評分之間的差異具有顯著性的意義(P＜0.05),AQP-1和VEGF、AQP-1與CD34及VEGF與CD34在試驗組中的表達均呈正相關(guān)(rs=0.398,0.583,0.439;P＜0.01),提示乙酰唑胺對AQP-1的抑制作用與腫瘤血管生成密切相關(guān),乙酰唑胺可能通過抑制腫瘤新生血管形成過程對腫瘤的生長發(fā)揮抑制作用。
　　 結(jié)論

16、:
　　 1 AQP-1主要在結(jié)直腸癌組織中的癌細胞漿呈高表達,而在癌旁組織的正常細胞漿呈低表達。AQP-1在結(jié)直腸癌組織中的高表達及其與病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系。證實AQP-1在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。AQP-1的深入研究有利于今后研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機制、指導其臨床診治及判斷預后。
　　 2 AQP-1與VEGF、CD34不同程度地表達于癌組織及癌旁組織,相關(guān)性分析具有顯著性的意義,說明AQP-1和結(jié)

17、直腸癌的血管生成密切相關(guān),AQP-1在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起促進癌細胞生長、轉(zhuǎn)移和具有血管生成作用。AQP-1可能作為結(jié)直腸癌靶向治療的新靶點。
　　 3水通道蛋白抑制劑乙酰唑胺能明顯抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長,腫瘤生長緩慢。AQP-1和VEGF、AQP-1與CD34及VEGF與CD34在試驗組中的表達均呈正相關(guān)(rs=0.398,0.583,0.439;P＜0.01),提示乙酰唑胺對AQP-1的抑制作用與腫瘤血管生成密切