包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的研制及其成骨和抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的： 研究包裹空白微球骨水泥的生物相容性和包裹多柔比星微球骨水泥的力學(xué)強度、體外降解和釋藥特點，觀察包裹多柔比星微球骨水泥的成骨作用和抗腫瘤性能。為包裹多柔比星微球骨水泥用于腫瘤切除術(shù)后骨缺損修復(fù)和抗腫瘤的可行性提供實驗依據(jù)。 方法： 1.包裹PLGA微球骨水泥的生物相容性 （1）骨水泥粉末的制備按化學(xué)沉淀法合成磷酸鈣晶體（PCCP），將PCCP和無水二磷酸鹽（DCPA）按1：1配置而成。 （2

2、）微球的制備采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備微球。 （3）純骨水泥的制備以15%的檸檬酸鈉作為水相，將CPC按體積重量比0.4 ml·g-1加入檸檬酸鈉溶液并均勻攪拌。然后在特制模具中制備成柱狀骨水泥。 （4）包裹微球骨水泥的制備將微球與CPC粉末以3：7的比例均勻混合，制備成柱狀包裹藥物微球骨水泥。 （5）實驗分組按研究對象不同，將細胞相容性實驗分為3組：空白對照組；CPC組，即純骨水泥組；CPC/M組，即包裹有微球的骨

3、水泥。體內(nèi)生物相容性研究中又將CPC組和CPC/M組各分為3個濃度或劑量亞組。 （6）材料和浸提液的制備浸提液的制備：材料稱重，密封后經(jīng)60Co滅菌，以每1g樣品加入10ml細胞培養(yǎng)液，在37℃，CO2體積分數(shù)為5%的無菌條件下浸提72h作為浸提液。 （7）細胞生長曲線將基質(zhì)干細胞細胞懸液，接種96孔板，每孔200μL，置于37℃±2℃，CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中開放培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。棄去培養(yǎng)液，加入等量的浸提

4、液，再放入37℃±2℃，CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、4、6、8、10天。在各觀察期加入CCK-8試劑，在免疫酶標儀上以450nm波長測定吸光度值。 （8）光鏡和電鏡觀察在每次進行細胞增殖實驗前，無菌操作下取出培養(yǎng)板，觀察浸提液和材料中各孔細胞的生長狀態(tài)。對材料組和浸提液組的細胞生長狀態(tài)進行觀察、分析。將人骨髓基質(zhì)干細胞接種于材料上，行掃描電鏡觀察。 （9）急性毒性實驗取昆明種小鼠30只，分為生理鹽水組（NS

5、）、CPC組和CPC/M組，分別行尾靜脈注射生理鹽水和2種浸提液原液，每只注射量1ml。注射后24 h、72h和120h稱量小鼠體重并觀察反應(yīng)。 （10）溶血試驗將不同濃度的材料生理鹽水浸提液（0.1g·ml-1、0.05g·ml-1、0.01 g·ml-1），生理鹽水（陰性對照）和雙蒸水（陽性對照），每組各5份，每管2ml。再在每管分別加入2%新鮮健康人血懸液2ml。在分光光度計540nm處測定各樣本光密度，計算溶血率。

6、 （11）微核試驗將80只小鼠隨機分成8組：2種材料的低（1ml）、中（2ml）、高（4ml）劑量組，陰性對照組（生理鹽水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg）。用30h給受試物法。取股骨常規(guī)涂片，涂片自然干燥后固定，Giemsa染色10～15min。在油鏡下觀察。每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核的嗜多染紅細胞數(shù)，每組以微核總數(shù)占5000個細胞中的比例計算。 （12）熱原試驗健康新西蘭白兔6只，間隔1h測量肛

7、溫3次，取平均值，確定為正常體溫。自耳緣靜脈緩慢注入無菌水泥浸提液，5 ml/只，注射后1，2，3h測定家兔體溫3次，與正常體溫相比，確定其升高度數(shù)。 2.包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的制備和表征 （1）實驗分組按研究對象不同，將實驗分為3組：A組（CPC組），即材料中只有骨水泥，不含藥物和藥物微球；B組（CPC/D組），即含有多柔比星（DOX）藥物的骨水泥；C組（CPC/M/D組），即包裹有DOX藥物PLGA微球的骨

8、水泥。 （2）電子顯微鏡觀察將微球、純骨水泥、載藥骨水泥、載微球骨水泥材料樣本行真空鍍膜儀噴金，用掃描電鏡在不同放大倍數(shù)下觀察樣本結(jié)構(gòu)特征，測量微球的粒徑。 （3）X線衍射法將骨水泥粉末與檸檬酸溶液按固液比為1：0.4（g：ml）混合后置于37℃，100%濕度下4周，然后用丙酮浸泡1h，真空干燥，采用X線衍射（XRD）分析儀測試樣品的化學(xué)成分。 （4）骨水泥的抗稀散性按體積重量比0.4 ml·g-1在骨水泥粉末中

9、加入檸檬酸鈉溶液并均勻攪拌，充分混合1min后制成球狀，迅速投入到生理鹽水（37℃）中靜置24h，通過肉眼觀察表面稀散情況進行評價。 （5）凝結(jié)時間分別對3組骨水泥的在25℃和37℃下凝結(jié)時間進行測定。用特定裝置對初凝時間和終凝時間分別進行測量。每個凝結(jié)時間測量6個標本，取平均值。 （6）可注射性用帶有1.6mm內(nèi)徑針頭的，針筒內(nèi)徑為14.5mm的注射器來測量3組骨水泥的可注射性能。在將骨水泥粉末與檸檬酸鈉混勻攪拌1mi

10、n后，立即將其倒入針筒中。在注射器內(nèi)芯的上方垂直加5kg的壓力2min。每組重復(fù)6次，記錄注射前后的骨水泥的針筒中的骨水泥的質(zhì)量并計算可注射性。 （7）孔隙率的測定根據(jù)Archimedean原理，根據(jù)排水（乙醇）法來粗略測量樣品的孔隙率。 （8）抗壓強度將試件置于萬能生物力學(xué)試驗機上進行最大抗壓強度的測定，施加載荷速度為0.1 mm·min-1，記錄標本樣條的最大抗壓強度和斷裂強度。 3.包裹多柔比星PLGA微球

11、骨水泥的體外釋藥和降解 （1）載藥率與包封率的測定準確稱取冷凍干燥的微球5mg溶于二甲亞砜中，超聲振蕩至微球完全溶解，將微球溶液用超速離心機離心2h，取上部溶液，用紫外分光光度計測定試樣在480nm處的吸光度。計算出各自DOX的含量。 （2）體外藥物釋藥特性取48個小瓶，每個瓶內(nèi)放置100mg微球，加入5ml的0.1mol·L-1 PH7.4的SBF液，37℃下浸泡24小時，隨機取6個小瓶的微球，按浸泡后第1、3、5、7

12、、10、14、21、28天留取浸出液，檢測各時間點浸出液在480nm處的吸光度，計算微球的釋藥量。 （3）CPC/D和CPC/M/D的體外釋藥特性從已制備好的2組含有藥物成份的骨水泥中各隨機抽取2塊骨水泥試樣，分別置于盛有SBF的燒杯中，測量浸提液在不同時間點的480nm處吸光度。記錄每個時間點測得的樣本吸光度，并計算出其釋藥量。 （4）載藥微球的體外降解精密稱取30等份，質(zhì)量均為100mg的DOX微球和空白微球，分別加

13、入SBF液浸泡，計錄不同時間點上微球的重量，計算微球的重量丟失。 （5）CPC、CPC/D和CPC/M/D的降解每組各取35個已制備好的干燥骨水泥標本，稱重后加入100 ml的SBF中浸泡。每次從各組取出6塊標本分別稱重，計算骨水泥樣本重量丟失；另外6塊用于測量其屈服應(yīng)力并進行電鏡觀察。 4.包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的體內(nèi)成骨作用 （1）實驗動物和分組2周齡新西蘭大白兔40只，隨機配成20對，將每對動物的4

14、個橈骨依次分成4組：空白組、CPC組、CPC/D組、CPC/M/D組。 （2）動物模型的制備實驗?zāi)Ｐ偷闹苽洌河?%戊巴比妥鈉（1ml/g）耳緣靜脈麻醉，然后制備雙側(cè)1.5 cm長的骨膜-橈骨缺損。對3個材料組的橈骨行材料植入，對空白組的橈骨只造成缺損模型，但不植入材料。 （3）大體觀察術(shù)后觀察動物飲食，活動情況，以及傷口有無腫脹、分泌物出現(xiàn)。取材后觀察成骨及材料降解情況。 （4）X線檢查術(shù)后2、4、8、16周各取

15、5對動物拍攝正位X射線片，觀察各組動物骨缺損區(qū)的骨痂生長、材料降解及骨連接情況。 （5）生物力學(xué)分別于術(shù)后2、4、8、16周隨機從3組材料組中取5對兔子處死，切取完整橈骨標本，剔凈骨膜及軟組織后，測量各組標本彎曲強度，取各組標本的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。 （6）骨水泥成分 X光衍射圖譜確定術(shù)后第4周時各組骨殘余骨水泥的成分。 （7）標本的病理學(xué)觀察術(shù)后16周時分別處死相應(yīng)組的大白兔，切除雙側(cè)橈骨，固定，脫鈣，脫水，

16、透明，石臘包埋后切片，烘干后脫蠟，常規(guī)HE染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察骨水泥在骨內(nèi)的代謝情況。 5.包裹載多柔比星PLGA微球骨水泥的抗腫瘤作用 6.統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)論: 制得的包裹PLGA微球骨水泥具有良好的生物相容性，而復(fù)合藥物PLGA微球的骨水泥同樣具有良好的可注射性、力學(xué)強度可等一般特性，包裹多柔比星微球骨水泥具有良好的降解和藥物緩釋作用。當(dāng)包裹多柔比星微球骨水泥植入體內(nèi)填充骨缺損時，可以促進新骨形成