紅苞鳳梨金邊嵌合體白化細(xì)胞葉綠素合成限速基因挖掘.pdf

1、本文以紅苞鳳梨金邊嵌合體扦插植株以及組織培養(yǎng)所獲得的全綠、全白植株為典型材料，通過DNA-AFLP分子標(biāo)記分析和轉(zhuǎn)錄組測序分析，并結(jié)合葉綠素合成前體物質(zhì)含量測定，尋找紅苞鳳梨金邊嵌合體白化細(xì)胞與綠色細(xì)胞在基因組DNA水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的差異，挖掘白化細(xì)胞葉綠素合成的關(guān)鍵限速基因，并利用Reeal time PCR技術(shù)對關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，進(jìn)一步驗(yàn)證其可能功能。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立了一套較為穩(wěn)定完善的紅

2、苞鳳梨DNA-AFLP分析技術(shù)體系，包括DNA提取、銀染、和顯影，并利用該體系對紅苞鳳梨組培全綠植株和全白植株進(jìn)行了檢測。本研究隨機(jī)選用69對AFLP引物對紅苞鳳梨組培全綠和全白植株進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增結(jié)果顯示，紅苞鳳梨組培全綠苗與全白苗的擴(kuò)增條帶一致，并沒有存在多態(tài)性條帶。紅苞鳳梨組培全綠苗與全白苗在我們使用的69對引物間并未發(fā)現(xiàn)基因組DNA長度的顯著差異。
　　2.以紅苞鳳梨嵌合體植株的葉、莖、根及帶紅暈葉片為材料，通過

3、RNA-seq測序，得到初始reads23.5M對，總堿基數(shù)為4.76 Gb。在測序質(zhì)量值統(tǒng)計(jì)評估方面，平均Q20為100％，堿基Q30為93.54％，GC含量為50.33％。通過對原始數(shù)據(jù)的過濾并利用Trinity軟件進(jìn)行拼接，共得到41，052條Unigenes，平均長度為877.62bp。與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共有23，275條unigenes比對到NCBI數(shù)據(jù)庫，23，134條unigenes比對到Swiss-Port數(shù)據(jù)庫。其

4、中，比對到GO和COG數(shù)據(jù)庫的unigenes分別為17，748和8，505條，共有5825條Unigenes被KEGG注釋參與到117個(gè)KEGG代謝通路，其中參與到卟啉和葉綠素代謝途徑（Ko號:Ko00860）的Unigene共有39條。
　　3.紅苞鳳梨金邊嵌合體綠葉部分的葉綠素a含量和葉綠素b含量及總?cè)~綠素含量分別為為白葉部分的35.2倍、16.7倍和24.18倍，說明白色葉葉綠素合成受阻，葉綠素含量顯著下降。葉綠素合成中間

5、代謝物δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量和膽色素原(PBG)含量在綠葉與白葉間無顯著差異，但自尿卟啉原Ⅲ（UroporphyrinogenⅢ）開始白葉含量極顯著減少，綠葉UroⅢ含量是白葉的4.7倍。同時(shí)，之后的糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)、原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、鎂原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)、原脫植基葉綠素(Pchlide)含量在白葉中均極顯著低于綠葉，說明PBG到UroⅢ的轉(zhuǎn)化是紅苞鳳梨白化細(xì)胞葉綠素合成受阻的限速步驟。

6、>　　4.本實(shí)驗(yàn)以5對可以擴(kuò)增出清晰條帶，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的候選內(nèi)參基因在紅苞鳳梨綠葉、白葉樣品中進(jìn)行Real time qPCR擴(kuò)增，采用geNorm和NormFinder兩個(gè)軟件進(jìn)行候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析，結(jié)果顯示18S rRNA為紅苞鳳梨葉片組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　5.采用Real time qPCR對葉綠素合成代謝途徑的12個(gè)基因(hemA、hemB、hemC、hemD、hemE、hemG、hemH